Θεμέλια λεκέδων, υλικά, τεχνική και χρήσεις του Wright



Το Το λεκέ του Wrigth είναι μια τεχνική χρωματισμού που δημιουργήθηκε από τον αμερικανικό παθολόγο James Omer Wright το 1902, από το λεκέ της Romanowsky. Καθώς η χρώση του Romanowsky ήταν ασταθής, η Wrigth ενσωμάτωσε τη μεθανόλη ως διαλύτη και σταθεροποιητή.

Αυτός ο χρωματισμός είναι πολυχρωματικός, που σημαίνει ότι παράγει διάφορα χρώματα ανάλογα με τη δομή που απορροφά η βαφή. Αυτή η τεχνική χρώσης έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη διεξαγωγή διαφορικών αριθμών λευκών αιμοσφαιρίων και τη μελέτη της μορφολογίας των ερυθροκυττάρων, των αιμοπεταλίων και των λευκοκυττάρων στο περιφερικό αίμα και στο μυελό των οστών..

Η εφαρμογή της είναι πολύ σημαντική, όπως μπορεί να φανεί ανωμαλίες σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές του αίματος, διευκολύνοντας την διάγνωση των ασθενειών όπως λευχαιμία ή βακτηριακές λοιμώξεις ή παρασιτικές.

Ίσως είναι αυτές οι πιο συνηθισμένες εφαρμογές στις οποίες χρησιμοποιείται αυτή η τεχνική, ωστόσο δεν είναι οι μόνοι. Είναι επίσης χρήσιμο σε δείγματα άλλα από το αίμα και το μυελό των οστών, όπως δείγματα ρινικής εκκρίσεως, βλέννας κόπρανα, πτύελα, δέρμα, μεταξύ άλλων..

Ευρετήριο

  • 1 Ίδρυση του λεκέ του Wright
  • 2 Υλικά
    • 2.1 Προετοιμασία
    • 2.2 Ρυθμιστικό διάλυμα με ρυθμιστικό διάλυμα
    • 2.3 Πρόσθετα υλικά που απαιτούνται για την εκτέλεση του χρωματισμού
  • 3 Συστατικά του λεκέ του Wright
    • 3.1 Μεθανόλη
    • 3.2 Το αμορτισέρ
    • 3.3 Εοσίνη (Υ)
    • 3.4 Κυανό του μεθυλενίου
  • 4 Τεχνική
  • 5 βοηθητικό πρόγραμμα
    • 5.1 Αιματολογία
    • 5.2 Ρινική έκκριση
    • 5.3 Παρασιτολογία
    • 5.4 Αναπνευστικές λοιμώξεις
    • 5.5 Βακτηριολογία
    • 5.6 Μυκητολογία
  • 6 Πώς παρατηρούνται οι δομές του δείγματος αίματος με τη βαφή του Wright;?
  • 7 Συστάσεις για καλές χρώσεις
  • 8 Συνηθισμένα λάθη στο χρωματισμό Wrigth
    • 8.1 Πολύ αχνά χρώση
    • 8.2. Κατακρημνίσεις του χρωστικού
    • 8.3 Μείγμα με εξαιρετικά κοκκινωπό ή μπλε χρώμα
  • 9 Κατάσταση αποθήκευσης
  • 10 Αναφορές

Θεμέλια λεκέδων του Ράιτ

Η κηλίδα του Wright γεννήθηκε από το λεκέ της Romanowsky, το οποίο αποτελείται από ένα διάλυμα μεθυλικής αλκοόλης από μία βαφή οξέος (εωσίνη Υ) και ένα βασικό (κυανό του μεθυλενίου) και τα προϊόντα οξείδωσης.

Το μίγμα χρωμάτων που χρησιμοποιείται στην χρωστική Wright έχει ως αποτέλεσμα γνωστό ως Romanowsky, δηλαδή παρέχει μια όμορφο μοβ χρωματισμό στους πυρήνες των λευκοκυττάρων και ουδετερόφιλων κοκκία, ενώ τα ερυθρά αιμοσφαίρια είναι χρωματισμένο ροζ.

Τα συστατικά υπεύθυνη για την παροχή της τυπικής περιοχής των χρωμάτων Wright λεκέ είναι μπλε Β και ηωσίνη Υ Η επίδραση που παρατηρήθηκε εξαρτάται από την πρόσδεση των βαφών με τις χημικές δομές και τις αλληλεπιδράσεις των μπλε Β και Ηωσίνη Y.

Οξικές δομές όπως νουκλεϊκά οξέα, πυρηνικές πρωτεΐνες και αντιδραστικό ανώριμο κυτταρόπλασμα κάποιων τύπων κυττάρων, καθορίζουν το μπλε Β (βασική χρωστική ουσία).

Ενώ οι βασικές δομές όπως η αιμοσφαιρίνη, οι κόκκοι των ηωσινοφίλων κατά διαστήματα, μεταξύ άλλων κυτταρικών δομών, σταθερό Ηωσίνη Y (όξινη βαφή).

Το αποτέλεσμα της χρώσης μπορεί να επηρεαστεί από διάφορους παράγοντες, όπως το ρΗ της βαφής Wright, το ρυθμιστικό διάλυμα και το διάλυμα πλύσης. καθώς και ο χρόνος χρώσης και στερέωσης.

Επομένως, κάθε βήμα στην προετοιμασία των αντιδραστηρίων είναι ζωτικής σημασίας και πρέπει να γίνει φροντίζοντας κάθε λεπτομέρεια.

Υλικά

Χρωματισμός Wright. Για 100 mL απαιτείται:

Ζυγίζεται 0,3 γρ βαφής Wright, μετρούνται 97 κ.εκ. μεθανόλης και 3 κ.εκ. γλυκερόλης.

Προετοιμασία

Σε ένα κονίαμα, τοποθετήστε τη βαριά ποσότητα βαφής του Wright και προσθέστε σιγά-σιγά τη γλυκερόλη μέχρι να διαλυθεί πλήρως η σκόνη..

Κατόπιν προστίθεται η μεθανόλη, αναμιγνύεται και χύνεται σε φιάλη κεχριμπαριού.

Πριν από τη χρήση του διαλύματος θα πρέπει να αναταράσσεται με απαλές κινήσεις και φίλτρο.

Buffer Buffer

Σε ένα λίτρο απεσταγμένου νερού, 3,76 g υδροφωσφορικού δινατρίου (Na2HPO4   2Η20) συν 2.1 γρ. Δισόξινο φωσφορικό κάλιο (ΚΗ)2PO4).

Αναμείξτε πολύ καλά μέχρι να διαλυθούν όλα τα ενσωματωμένα αντιδραστήρια. Ρυθμίστε το pH στο 7,2. Ρίχνουμε σε γυάλινο βάζο και κρατάμε σε θερμοκρασία δωματίου.

Πρόσθετα υλικά που απαιτούνται για την εκτέλεση του χρωματισμού

φύλλα αντικειμενικών φακών ή coverglass, γέφυρα χρωματισμό pisetas με νερό ή ρυθμιστικό διάλυμα για το πλύσιμο, ένα χρονόμετρο για να μεταφέρουν τους χρόνους χρώσης και ένα ξηραντικό υλικό: Επιπρόσθετα άλλα υλικά για τη διεξαγωγή τεχνική χρώσης, αυτές απαιτούνται (απορροφητικό χαρτί, γάζα ή βαμβάκι).

Συστατικά λεκέδων Wright

Μεθανόλη

Το αλκοόλ (μεθανόλη) χρησιμεύει ως σταθεροποιητικό του επιχρίσματος του αίματος στη διαφάνεια.

Βασικά είναι ένα αναγωγικό αντιδραστήριο, αφυγραντήρας και σταθεροποιητικό πηκτής. Ως εκ τούτου, η λειτουργία του είναι να πήξει τις πρωτεΐνες και να τις κάνει αδιάλυτες, αλλά χωρίς να τις μετουσιώσουν.

Η μεθανόλη είναι το ευρύτερα χρησιμοποιούμενο αντιδραστήριο για την επιδιόρθωση επιχρισμάτων σε όλα τα εργαστήρια, δεδομένου ότι παρέχει καλύτερα αποτελέσματα από εκείνα που λαμβάνονται με την αιθανόλη. Η ιδανική συγκέντρωση είναι 99%.

Το αμορτισέρ

Το ρυθμιστικό διάλυμα (ρυθμιστικό διάλυμα), του οποίου η λειτουργία είναι να προσαρμόσει ή να διατηρηθεί το ρΗ της βαφής, ως ρΗ ρυθμίστηκε στο 7,2 είναι απαραίτητη για κυτταρικές δομές μπορεί να απορροφήσει βαφές σωστά.

Από την άλλη πλευρά, το πέρασμα της σταθεροποίησης της μεθανόλης αφυδατώνει τα κύτταρα και το ρυθμιστικό διάλυμα βοηθά στην ενυδάτωση τους.

Ηωσίνη (Υ)

Η ηωσίνη έχει συνάφεια για τα βασικά συστατικά επειδή είναι μια όξινη βαφή. Δύο τύποι ηωσίνης είναι πολύ παρόμοιοι μεταξύ τους, οπότε μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένα από τα δύο, επιτυγχάνοντας το ίδιο αποτέλεσμα.

Η μία ονομάζεται εωσίνη Υ, κίτρινη ηωσίνη ή τετραβρωμοφθορεσκεΐνη και η άλλη ηωσίνη Β, μπλε ερυθροσίνη Β ή διβρωμοδινιτροφθορεσκεΐνη. Ωστόσο, η ηωσίνη Υ είναι η συνηθέστερα χρησιμοποιούμενη.

Η σημαντικότερη ιδιότητα αυτής της χρωστικής είναι η αρνητική της πολικότητα, γεγονός που την καθιστά ελκυστική από κυτταρικές δομές με θετικό φορτίο.

Μπλέ μεθυλενίου

Είναι ο βασικός χρωματισμός. Η κύρια ιδιότητά της είναι η μεταχρωμάσια, δηλαδή, όχι όλες οι δομές πρόκειται να βαφτούν στο ίδιο χρώμα, εξαρτάται από τη χημική σύνθεση των δομών που είναι χρωματισμό.

Μερικοί θα μετατρέψουν το φως ή σκούρο μπλε και άλλα σκούρο μοβ ή ανοιχτό πασχαλιά.

Τεχνική

1-Εκτελέστε την εξάπλωση του δείγματος έτσι ώστε να παραμένει μια λεπτή μεμβράνη, είτε σε μια ολίσθηση είτε στην επικάλυψη.

2-Αφήστε τον αέρα να στεγνώσει για περίπου 2 ώρες.

3-Τοποθετήστε το στεγνό επίχρισμα στη γέφυρα λεύκανσης ή στο δίσκο χρώσης με το δείγμα να εξαπλώνεται προς τα πάνω.

4-Καλύψτε το φύλλο με τη σταγόνα βαφής Wright με σταγόνα μέχρι να καλύψει ολόκληρη την επιφάνεια. Αφήστε το για 5 - 8 λεπτά.

5 - Η βαφή πρέπει να καλύπτει πλήρως την ολίσθηση, χωρίς να χυθεί πάνω από τις άκρες. Εάν κατά τη διάρκεια του χρόνου χρωματισμού αρχίσει να εξατμίζεται, πρέπει να τοποθετηθούν επιπλέον σταγόνες.

6-Στη συνέχεια, προσθέστε μια ίση ποσότητα του αμορτισέρ, χτυπήστε λίγο μέχρι να εμφανιστεί η χαρακτηριστική μεταλλική λάμψη. Πάρτε 10 έως 15 λεπτά.

7-Πλύνετε με νερό της βρύσης, τοποθετώντας το μαλακό πίδακα μέχρι το φύλλο να φαίνεται ροζ.

8-Με μια γάζα εμποτισμένη με αλκοόλη αφαιρέστε τη βαφή που είναι προσαρτημένη στο πίσω μέρος της ολίσθησης.

9 - Αφήστε το επίθεμα να στεγνώσει πολύ καλά πριν τοποθετήσετε το εμβαπτιζόμενο λάδι για να το απεικονίσετε στο μικροσκόπιο.

Βοηθητικό πρόγραμμα

Αιματολογία

Είναι ιδανικό για το κηλίδωμα επιχρισμάτων περιφερικού αίματος, για εξέταση παχύρρευστων κηλίδων αίματος και για μελέτη κυττάρων από δείγματα μυελού των οστών.

Λόγω των χημικών ιδιοτήτων αυτού του συνδυασμού βαφών οι κυτταρικές δομές μπορούν εύκολα να αναγνωριστούν, είναι ικανές να διακρίνουν τους διαφορετικούς τύπους κυττάρων που υπάρχουν.

Ρινική έκκριση

Αυτή η τεχνική είναι πολύ χρήσιμο για την ταυτοποίηση κυττάρων σε ρινικό έκκριμα (επιθηλιακά κύτταρα, ηωσινόφιλα κατά διαστήματα, πολυμορφοπύρηνα) στη διάγνωση της αλλεργικής ρινίτιδας.

Παρασιτολογία

Με αυτή την έννοια, ήταν χρήσιμο για τη μελέτη του Leishmania sp μέσα στα ιστιοκύτταρα του υποδόριου κυτταρικού ιστού στα έλκη του δέρματος. Παρομοίως, χρησιμοποιείται για την αναγνώριση των λευκοκυττάρων σε δείγματα κοπράνων (leucogram των κοπράνων).

Σε αυτή την περίπτωση, είναι ενδιαφέρον για το γιατρό να γνωρίζει αν η λευκοκυττάρωση που υπάρχει στα κόπρανα είναι από πολυμορφοπύρηνα ή μονοπύρηνα. Αυτό το εύρημα στο κοκκώδες leucogram θα καθοδηγήσει αν είναι βακτηριακή ή ιική μόλυνση αντίστοιχα.

Από την άλλη πλευρά, τα παράσιτα που κυκλοφορούν στο αίμα μπορούν να βρεθούν μέσα στο ερυθροκύτταρο ή ελεύθερα στο πλάσμα. Τα επιθυμητά παράσιτα είναι Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii και filarias, και στην κτηνιατρική είναι χρήσιμη στην αναζήτηση Theileria equi και Babesia caballi, οι αιτιολογικοί παράγοντες των μωρών, ιδίως στα ιπποειδή.

Η βαφή Wright και Giemsa μπορεί να διαφοροποιήσει τα αιμοπαράσιτα από τα φυσιολογικά κυτταρικά συστατικά. Για αυτό μπορείτε να χρησιμοποιήσετε δύο τύπους spreads:

Λεπτές εκτάσεις

Το αίμα απλώνεται σαν λεπτό φιλμ σε μια διαφάνεια. Βαφή με λεκές του Wright, αποκαλύπτοντας τα χαρακτηριστικά του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος.

Μεγάλη πτώση

Αυτή η μεθοδολογία χρησιμοποιείται για να διερευνήσει την παρουσία παρασίτων σε μεγαλύτερη ποσότητα αίματος.

Για αυτό, μια μεγάλη σταγόνα αίματος τοποθετείται σε μια διαφάνεια. Αφού βρεθείτε εκεί, θα πρέπει να αφαιρέσετε τον απινιδωτή, δημιουργώντας μεγαλύτερους και μεγαλύτερους κύκλους από το κέντρο προς τα έξω, χρησιμοποιώντας την άκρη μιας άλλης διαφάνειας.

Τέλος, για να παρατηρηθούν τα παράσιτα στο παχύ επίχρισμα, τα ερυθροκύτταρα πρέπει να λυθούν με νερό.

Αναπνευστικές λοιμώξεις

Σε επίπεδο αναπνευστικού, αυτή η τεχνική είναι επίσης χρήσιμη, επειδή τα κύτταρα που υπάρχουν στα δείγματα πτυέλων, η βρογχική ή η βρογχοκυψελιδική έκπλυση είναι σημαντικά για την καθιέρωση της διάγνωσης.

Παρομοίως, εδώ μπορούν να διακριθούν πολυμορφοπύρηνα κύτταρα και μονοπύρηνα κύτταρα.

Βακτηριολογία

Η χρήση αυτής της τεχνικής σε βακτηριολογία είναι περιορισμένη, επειδή δεν είναι καλό για τη χρώση των βακτηρίων, η οποία είναι ο λόγος για χρώση αυτών άλλες εξειδικευμένες τεχνικές που χρησιμοποιούνται για ζωγραφική.

Ωστόσο, έχει χρησιμοποιηθεί για την αναζήτηση επιθηλιακών κυττάρων με σώματα εγκλεισμού Chlamydia trachomatis σε επιχρίσματα του ουρηθρικού ή ενδοκοιλιακού βλεννογόνου, αν και πρέπει να αναγνωριστεί ότι δεν είναι η καλύτερη μέθοδος γι 'αυτό.

Είναι επίσης δυνατόν να παρατηρηθούν βακτηρίδια σπειροειδούς τύπου μεταξύ των ερυθρών αιμοσφαιρίων όπως Borrelia burgdorferi σε μολυσμένους ασθενείς, καθώς και σε morulae ή έγκλειστοι οργανισμοί του Ehrlichia sp στο κυτταρόπλασμα λεμφοκυττάρων, μονοκυττάρων ή ουδετερόφιλων σε ένα επίχρισμα αίματος.

Μυκολογία

Το Histoplasma capsulatum είναι ένας παθογόνος μύκητας διαγνωσμένος συχνά με μικροσκοπική παρατήρηση διαφόρων δειγμάτων ιστών, χρωματισμένο με χρώση Wright.

Πώς παρατηρούνται οι δομές του δείγματος αίματος με το λεκέ του Wright?

Συστάσεις για καλές χρώσεις

Οι επεκτάσεις των δειγμάτων αίματος πρέπει να ξηρανθούν στον αέρα αυθόρμητα. Τα επιχρίσματα θα πρέπει να είναι όσο το δυνατόν λεπτότερα ώστε να επιτυγχάνεται καλύτερη σταθεροποίηση της βαφής και να αποφεύγονται οι υπερκορεσμοί.

Για βαφή υψηλής ποιότητας, συνιστάται η χρώση να πραγματοποιείται κατά τη διάρκεια των δύο ωρών που ακολουθούν την προετοιμασία του επιχρίσματος. Από την άλλη πλευρά, το ιδανικό δείγμα είναι το τριχοειδές αίμα, χωρίς αντιπηκτικό.

Ωστόσο, εάν το φλεβικό αίμα χρησιμοποιείται θα πρέπει να χρησιμοποιείται ως αντιπηκτικό EDTA και ηπαρίνη δεν έκανε, δεδομένου ότι η τελευταία μπορεί να παραμορφωθεί κυτταρικές δομές.

Για να αποφευχθεί η φθορά του παρασκευασμένου χρωστικού πρέπει να φυλάσσεται σε ξηρά μέρη.

Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας πλύσης συνιστάται η χρήση νερού προσαρμοσμένου στο ουδέτερο pH.

Τέλος, καλό είναι να δοκιμάζετε τόσο συχνά τις μεθόδους βαφής που χρησιμοποιούνται στο εργαστήριο.

Αυτό γίνεται με τη βαφή δειγμάτων ή εκτεταμένων μοτίβων, ως ποιοτικού ελέγχου. Αυτό το βήμα είναι σημαντικό, καθώς αυτό εξασφαλίζει ότι η χρώση είναι σωστά προετοιμασμένη και οι χρόνοι χρωματισμού είναι καλά τυποποιημένοι.

Εάν το φύλλο μοτίβου έχει έντονο χρώμα, τότε υπάρχουν προβλήματα που πρέπει να επιλυθούν.

Συνηθισμένα λάθη στο χρωματισμό Wrigth

Πολύ απαλό κηλίδωμα

Πολύ ανοιχτόχρωμο επίχρισμα, συνήθως λόγω πολύ μικρού χρόνου χρώσης ή υπερβολικού πλυσίματος. Διορθώνεται με την επιμήκυνση του χρόνου επαφής με τη βαφή ή με τη μείωση του χρόνου πλύσης.

Η βαφή κατακρημνίζεται

Το επίχρισμα χρωστικής καθίζησης μπορεί να έχει διάφορες αιτίες, ωστόσο, οι πιο συχνές αιτίες είναι: η χρήση της χρωστικής αφιλτράριστο βαφής σε γέφυρες χρωματισμό ανώμαλο, χρησιμοποιώντας βρώμικα σεντόνια με σκόνη ή γράσο, να κάνει ένα καλό πλύσιμο του Τελειώστε τη χρώση.

Κρέμα με εξαιρετικά κοκκινωπό ή μπλε χρώμα

Ο ρυθμιστής είναι υπεύθυνος για το ρΗ του χρωστικού. Οι χρωστικές με ρΗ κάτω από την αναφερόμενη (οξύ) θα έχουν πολύ κόκκινα επιχρίσματα.

Εάν το ρΗ της χρωστικής είναι πάνω από (αλκαλικό), θα αποκτηθεί ένα εξαιρετικά μπλε χρώμα.

Τρόπος αποθήκευσης

Το αντιδραστήριο πρέπει να φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου.

Αναφορές

  1. V. Gutierrez Συγκριτική μελέτη μεταξύ μέθοδος χρώσης Wright και δοκιμής Elisa για τη διάγνωση του σκύλου ερλιχίωση στην πόλη του San Pedro Sula, Ονδούρα. 2008. Διδακτορική διατριβή για την υποβολή αίτησης για τον τίτλο του κτηνιάτρου. Πανεπιστήμιο του Σαν Κάρλος της Γουατεμάλας.
  2. Lopez-Jácome L, Hernandez-Durán Μ, C Colin-Castro, Pena-Ortega S, G Ceron-González, F. Franco-Cendejas Βασικές χρωστικές στο εργαστήριο μικροβιολογίας. Έρευνα για την αναπηρία. 2014; 3 (1): 10-18.
  3. "Το λεκέ του Ράιτ." Wikipedia, Η ελεύθερη εγκυκλοπαίδεια. 18 Μαΐου 2018, 12:05 UTC. 8 Δεκεμβρίου 2018, 20:37
  4. Calderón Α, Cardona J, Vergara Ó. Συχνότητα του Babesia spp. στα άλογα των μοντερίων, Κόρδοβα (Κολομβία). Αναθ.  2013 · 16 (2): 451-458.
  5. Forbes Β, Sahm D, Weissfeld Α (2009). Μικροβιολογική διάγνωση της Bailey & Scott. 12 ed. Αργεντινή Πανamericana S.A Σύνταξη.
  6. Retamales E, Mazo V. Ινστιτούτο Δημόσιας Υγείας Κυβέρνηση της Χιλής. Συστάσεις για τη χρώση των κηλίδων αίματος για την ανάγνωση του αριθμού των αιμοπεταλίων.