Gram βαφή θεμέλια, υλικά, τεχνική και χρήσεις

Το Γραμμική κηλίδα είναι η απλούστερη και πιο χρήσιμη τεχνική βαφής στη διαγνωστική μικροβιολογία. Αυτή η τεχνική δημιουργήθηκε από το δανικό γιατρό Hans Christian Gram το 1884, ο οποίος κατάφερε να ταξινομήσει τα βακτήρια σε Gram θετικά και Gram αρνητικά, σύμφωνα με τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος.

Η τεχνική που υπέστη τροποποιήσεις από Hucker το 1921 για τη σταθεροποίηση των αντιδραστηρίων και βελτιώνουν την ποιότητα της χρώσης, έτσι χρώση Gram είναι επίσης γνωστή ως Gram-Hucker.

Με την τεχνική αυτή είναι δυνατόν να παρατηρήσουμε τη μορφή μικροοργανισμών, δηλαδή, αν κόκκοι, βάκιλοι, κοκκοβάκιλλοι, πλειομορφικές, νηματοειδή, μεταξύ άλλων. Εκτός από τη διανομή του στο διάστημα: σε σύμπλεγμα, σε αλυσίδα, απομονωμένη, σε ζεύγη, τετράδες κ.λπ..

Όταν υπάρχει υποψία βακτηριακής μόλυνσης, τα περισσότερα από τα δείγματα που λαμβάνονται θα πρέπει να απλώνονται σε μια διαφάνεια και να χρωματίζονται με Gram για εξέταση κάτω από το μικροσκόπιο..

Η αναφορά του Gram θα καθοδηγήσει τον γιατρό σε ποιο τύπο μικροοργανισμού μπορεί να είναι η αιτία της μόλυνσης, προτού πάρει το τελικό αποτέλεσμα της καλλιέργειας.

Σε ορισμένες περιπτώσεις η ζωή του ασθενούς είναι πολύ περιορισμένη, οπότε οι γιατροί χρειάζονται επειγόντως την έκθεση Gram για να πραγματοποιήσουν μια εμπειρική θεραπεία, περιμένοντας την ταυτοποίηση του μικροοργανισμού.

Για παράδειγμα, εάν η Gram αποκαλύπτει εκεί Gram θετικούς κόκκους στο CSF, ο γιατρός καθοδηγεί την αρχική αντιβιοτική θεραπεία για την εξάλειψη αυτών των τύπων των βακτηρίων, σύμφωνα με πρωτόκολλα που καθορίζονται για αυτό.

Μόλις φτάσει το τελικό αποτέλεσμα με το όνομα του απομονωμένου μικροοργανισμού και του αντίστοιχου αντιβιογράμματος, ο γιατρός θα αξιολογήσει εάν θα αλλάξει ή όχι τη θεραπεία. Η απόφαση αυτή θα γίνει σύμφωνα με τη μελέτη της ευαισθησίας του μικροοργανισμού στα αντιβιοτικά που λαμβάνει και την εξέλιξη του ασθενούς.

Ευρετήριο

• 1 Ίδρυμα
• 2 Υλικά
• 3 Παρασκευή χρωστικών ουσιών και αντιδραστηρίων
  • 3.1 Διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους
  • 3.2 Ιωδο-Lugol
  • 3.3 Λεύκανση
  • 3.4 Αντίθεση
• 4 Αποθήκευση αντιδραστηρίων
• 5 Προετοιμασία της διασποράς του δείγματος προς χρώση
  • 5.1 -Γράμμα άμεσων δειγμάτων
  • 5.2 -Γράμμα καλλιεργειών
• 6 Τεχνική
• 7 Βοηθητικό πρόγραμμα
• 8 Συχνά λάθη
• 9 Αναφορές

Ίδρυμα

Αυτή είναι μια τεχνική που παρουσιάζει 4 θεμελιώδη βήματα: τη χρώση, τη σταθεροποίηση με το νεκρό, τον αποχρωματισμό και την αντιδιαστολή. Επομένως, αυτή η τεχνική εκτός από το χρωματισμό των βακτηρίων, τα διαφοροποιεί επίσης.

Το κρυσταλλικό ιώδες είναι το πρώτο χρώμα που χρησιμοποιείται. Έχει μια συγγένεια για πεπτιδογλυκάνη και λεκέ μωβ όλα τα βακτήρια στη συνέχεια Lugol, ενεργώντας ως διαβρωτικά, που τοποθετείται, θα επάγει το σχηματισμό αδιάλυτων συμπλοκών του κρυσταλλικού ιώδους-ιωδίου - ribonuclear πρωτεΐνες εντός του κυττάρου.

Τα θετικά κατά Gram βακτήρια, που έχουν ένα παχύ τοίχωμα πεπτιδογλυκάνης, σχηματίζουν περισσότερα σύμπλοκα (κρυσταλλικό ιώδιο-ιώδιο), επομένως διατηρούν τη βαφή.

Επίσης, επηρεάζει το γεγονός ότι το Gram-θετικό βακτηριακό τοίχωμα περιέχει μεγαλύτερη ποσότητα ακόρεστων οξέων, τα οποία εμφανίζουν υψηλή συγγένεια για οξειδωτικούς παράγοντες (Lugol).

Εν τω μεταξύ, τα Gram-αρνητικά βακτήρια έχουν ένα λεπτό στρώμα πεπτιδογλυκάνης, το οποίο καθιστά τα βακτήρια λιγότερο πολύπλοκα από τα Gram-θετικά βακτήρια.

Στη συνέχεια έρχεται το βήμα του αποχρωματισμού, όπου τα Gram θετικά και Gram αρνητικά βακτήρια συμπεριφέρονται διαφορετικά.

Τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια περιέχουν μια εξωτερική μεμβράνη πλούσια σε λιποπολυσακχαρίτες που είναι μέρος του κυτταρικού τοιχώματος της. Τα λίπη καταστρέφονται με επαφή με ακετόνη αλκοόλης, έτσι ώστε η εξωτερική μεμβράνη να αποσταθεροποιείται, ενώ ο ιώδης κρύσταλλος απελευθερώνεται.

Αυτός είναι ο τρόπος με τον οποίο στη συνέχεια αντισταθμίζεται με σαφρανίνη ή βασική φούξιν, λαμβάνοντας το χρώμα κόκκινο.

Στην περίπτωση Gram θετικών βακτηριδίων, ανθεκτικές στο ξεθώριασμα ότι η αποχρωματισμού δρα για να κλείσει τους πόρους, η οποία εμποδίζει βιολετί / ιωδίου σύμπλοκο κρύσταλλο μπορεί να περάσει.

Επομένως, ο χρωματισμός με τον ιώδη κρύσταλλο είναι σταθερός και δεν υπάρχει χώρος για τη σαφαρανίνη ή τη φουκσινη. Εξαιτίας αυτού, αυτά τα βακτήρια λεκιάζουν έντονα μπλε ή μοβ.

Υλικά

Το σετ χρωματισμού Gram αποτελείται από:

• Κίτρινο κρύσταλλο
• Lugol
• Ακετόνη αλκοόλη
• Σαφρανίνη ή βασική φουξίνη

Παρασκευή βαφών και αντιδραστηρίων

Κρύσταλλο ιώδες διάλυμα

Λύση Α:

Κίτρινο κρύσταλλο -2 γρ

Αιθυλική αλκοόλη 95% -20cc

Λύση B:

Οξαλικό αμμώνιο -0,8 gr

Αποσταγμένο νερό - 80 cc

Για την τελική παρασκευή του ιώδους κρυστάλλου, το διάλυμα 1:10 πρέπει να αραιωθεί με αποσταγμένο νερό και να αναμιχθεί με 4 μέρη διαλύματος Β. Το μίγμα φυλάσσεται για 24 ώρες πριν από τη χρήση. Διηθούμε σε μια φιάλη για χρώση με κεχριμπάρι χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο χαρτιού.

Το ποσό που θα χρησιμοποιηθεί καθημερινά μεταφέρεται σε πορτοκαλί φιάλη με σταγονόμετρο.

Iodo-Lugol

Ζυγίστε και μετρήστε την υποδεικνυόμενη ποσότητα κάθε ένωσης, ως εξής:

Κρύσταλλοι Ιωδιού - 1γρ

Ιωδιούχο κάλιο - 2γρ

Αποσταγμένο νερό -300 κυβ

Το ιωδιούχο κάλιο διαλύεται λίγο στο νερό και στη συνέχεια προστίθεται το ιώδιο. Η λύση ξυρίζεται σε φιάλη κεχριμπαρένιου χρώματος.

Το ποσό που θα χρησιμοποιηθεί καθημερινά μεταφέρεται σε μικρότερο πορτοκαλί φιαλίδιο με σταγονόμετρο.

Λευκαντικό

95% αιθυλική αλκοόλη -50 ml

Ακετόνη - 50 ml

Παρασκευάζεται σε ίσα μέρη. Καλύψτε καλά, τείνει να εξατμιστεί.

Τοποθετήστε σε μια φιάλη με σταγονόμετρο.

Αυτό το παρασκεύασμα παρέχει αποχρωματισμό σε μέτριο χρόνο 5-10 δευτερόλεπτα και είναι το πιο συνιστώμενο.

Οι αρχάριοι προτιμούν να χρησιμοποιούν μόνο 95% αιθυλική αλκοόλη, όπου ο αποχρωματισμός είναι πιο αργός από 10 έως 30 δευτερόλεπτα.

Ενώ οι πιο έμπειροι μπορούν να χρησιμοποιήσουν καθαρή ακετόνη, όπου αποχρωματισμός συμβαίνει πολύ γρήγορα από 1 έως 5 δευτερόλεπτα.

Αντίθεση

Σαφρίνη αποθεματικό διάλυμα

Σαφράνη -2,5 γρ

Αιθυλική αλκοόλη 95% -100 cc

Μετά τη ζύγιση της ενδεικνυόμενης ποσότητας σαφρανίνης διαλύεται σε 100 κ.εκ. αιθυλικής αλκοόλης έως 95%.

Το διάλυμα εργασίας σαφαρανίνης παρασκευάζεται από το αποθεματικό διάλυμα.

Για να γίνει αυτό, μετρήστε 10 cc του αποθέματος διαλύματος, προσθέστε 90 cc απεσταγμένου νερού για να συμπληρώσετε 100 ml.

Συνιστάται να μεταφέρετε την ποσότητα που θα χρησιμοποιηθεί καθημερινά σε φιαλίδιο χρώματος πορτοκαλί με σταγονόμετρο.

Μικροοργανισμοί που κηλιδώνονται ασθενώς Gram-αρνητικοί με βαφή Gram-Hucker, όπως ορισμένα αναερόβια, Legionella sp, Campylobacter sp και Brucella sp, μπορεί να είναι πολύ καλύτερα χρωματισμένα αν χρησιμοποιηθεί η τροποποίηση που έκανε η Kopeloff στη χρώση Gram-Hucker, που ονομάζεται λεκιά Gram-Kopeloff.

Αυτή η τεχνική αλλάζει τη βαφή σαφρανίνης με βασική φουκσινη. Με αυτή την τροποποίηση είναι δυνατόν να χρωματίσουμε αποτελεσματικά τους προαναφερθέντες μικροοργανισμούς.

Αποθήκευση αντιδραστηρίων

Οι παρασκευασμένες χρωστικές πρέπει να φυλάσσονται σε θερμοκρασία δωματίου.

Προετοιμασία του δείγματος σε χρώμα

Ένα δείγμα πρέπει να περιέχει τουλάχιστον 10⁵ μικροοργανισμών πριν από την παρατήρηση του μικροοργανισμού σε ένα επίχρισμα είναι πιθανό. Οι διανομές μπορούν να γίνουν από το άμεσο δείγμα ή καλλιέργειες σε στερεά ή υγρά μέσα.

Οι διανομές πρέπει να είναι ομοιόμορφες, καλά κατανεμημένες και όχι πάχους, για καλύτερη απεικόνιση των δομών που υπάρχουν.

-Γράμμα άμεσων δειγμάτων

Γράμμα ούρων χωρίς φυγόκεντρο

Τα ούρα αναμιγνύονται και τοποθετούνται 10 μl σε μια ολίσθηση. Η παρατήρηση τουλάχιστον ενός βακτηρίου / πεδίου εμβάπτισης υποδεικνύει ότι υπάρχει μόλυνση.

Αυτό σημαίνει ότι η καλλιέργεια θα έχει περίπου περισσότερο από 100.000 CFU / ml (10⁵ CFU / mL) ούρων σε 85% των περιπτώσεων.

Αυτή η μέθοδος δεν είναι χρήσιμη για μετρήσεις αποικιών κάτω από 100.000 CFU.

LCR Gram

Το CSF θα πρέπει να φυγοκεντρείται, το υπερκείμενο απομακρύνεται και το σφαιρίδιο να απλώνεται σε μια ολίσθηση. Αυτό το υγρό είναι αποστειρωμένο υπό κανονικές συνθήκες. η παρατήρηση των βακτηρίων υποδεικνύει μόλυνση.

Γράμμα αναπνευστικών δειγμάτων

Η πτύελα Gram, βρογχικό ή βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, ενώ μπορεί να υπάρχουν ποικιλίας μικροοργανισμών, προσανατολίζουν πάντοτε στη διάγνωση καθώς επίσης και όντας χρήσιμα κύτταρα τύπου παρατηρήθηκε.

Στην περίπτωση των πτυέλων, το επίχρισμα πρέπει να παρασκευάζεται με τα πιο πυώδη τμήματα του δείγματος.

Σκαμπό Gram

Δεν συνιστάται η εκτέλεση Gram σε αυτό το είδος δειγμάτων, δεδομένου ότι δεν έχει διαγνωστική αξία.

-Gram καλλιέργειες

Μπορούν να γίνουν με δύο τρόπους, ένας από υγρές καλλιέργειες και άλλος από στερεές καλλιέργειες.

Υγρές καλλιέργειες

Από υγρές καλλιέργειες είναι εξαιρετικά απλή. υπό τον αναπτήρα αρκετές Ψημένα βρώμικο ζωμό που λαμβάνονται και τοποθετούνται σε ένα καθαρό και στεγνό διαφάνειες, δίνοντας μια κυκλική κίνηση από το κέντρο προς την περιφέρεια, για να κατανεμηθεί το υλικό ομοιόμορφα.

Αφήνεται να ξηρανθεί αυθόρμητα στον αέρα. Αφού στεγνώσει, το υλικό στερεώνεται στο φύλλο με θερμότητα. Γι 'αυτό, με τη βοήθεια ενός σφιγκτήρα, το φύλλο 3 διέρχεται 4 φορές μέσω της φλόγας του καυστήρα Bunsen, προσέχοντας να μην καεί το υλικό.

Το φύλλο αφήνεται να ψυχθεί και τοποθετείται επί της γέφυρας χρωματισμού.

Στερεές καλλιέργειες

Για να εκτελέσετε μια επέκταση για βαφή Gram από μια στερεή καλλιέργεια, ακολουθήστε τα εξής:

Πριν από την επιλογή των αποικιών που πρόκειται να ληφθούν, πρέπει να προετοιμαστεί ο ολισθητήρας, τοποθετώντας δύο σταγόνες περίπου αποστειρωμένου φυσιολογικού αλατούχου διαλύματος.

Εάν η αρχική πλάκα καλλιέργειας περιέχει αρκετούς διαφορετικούς τύπους αποικιών, μια απομονωμένη αποικία του καθενός θα επιλεγεί για να εκτελέσει το Gram. Κάθε αποικία θα ληφθεί με τον βρόχο πλατίνα για να τη διαλυθεί στο αλατούχο διάλυμα που προηγουμένως τοποθετήθηκε στην ολίσθηση.

Κυκλικές κινήσεις δίνονται από το κέντρο προς την περιφέρεια, για να κατανέμεται η αποικία ομοιογενώς στη διαφάνεια..

Αφήνεται να ξηρανθεί αυθόρμητα στον αέρα. Μόλις στεγνώσει το φύλλο στερεώνεται με θερμότητα, όπως εξηγήθηκε ανωτέρω (κουνώντας το κλείστρο με τον καυστήρα), προσέχοντας να μην καεί το υλικό.

Αυτή η διαδικασία πρέπει να εκτελείται με κάθε διαφορετικό τύπο αποικίας. Σε ένα κομμάτι χαρτί πρέπει να σημειωθεί η σειρά των παρατηρούμενων, για παράδειγμα:

Αποικία 1: Κίτρινη βήτα-αιμολυτική αποικία: Στα θετικά κατά Gram κοκκία παρατηρήθηκαν σε συστάδες

Αποικία 2: Αποικία κρέμας, χωρίς αιμόλυση: παρατηρήθηκαν αρνητικά κατά Gram κοκκοβακίλλια.

Κάθε φύλλο πρέπει να επισημαίνεται για να γνωρίζει τι παρατηρούμε.

Τεχνική

Η τεχνική βαφής Gram είναι εξαιρετικά απλή στην εκτέλεση και σχετικά φθηνή και δεν μπορεί να χαθεί σε ένα εργαστήριο μικροβιολογίας.

Το ίδιο ισχύει και ως εξής:

1. Στερεώστε το επίχρισμα με θερμότητα και τοποθετήστε το πάνω στη χρωματιστή γέφυρα.
2. Το φύλλο καλύπτεται πλήρως με βιολετί για 1 λεπτό.
3. Πλύνετε με νερό. Μην στεγνώνετε
4. Καλύψτε την πλάκα με διάλυμα Lugol, αφήστε για 1 λεπτό. Πλύνετε με νερό. Μην στεγνώνετε.
5. Ανάμειξη για 5-10 δευτερόλεπτα με ήπια ανάδευση σε αλκοόλη ακετόνης. Ή τοποθετήστε το φύλλο σε όρθια θέση και ρίξτε σταγονίδια του παράγοντα αποχρωματισμού στην επιφάνεια μέχρι να απομακρυνθεί το υπόλοιπο μοβ γυαλί. Μην υπερβαίνετε.
6. Πλύνετε με νερό. Μην στεγνώνετε.
7. Αντικαταστήστε το φύλλο στη χρωματιστή γέφυρα και καλύψτε για 30 δευτερόλεπτα με σαφρανίνη (Gram-Hucker) ή 1 λεπτό με βασική φούξιν (Gram-Kopeloff).
8. Πλύνετε με νερό
9. Αφήστε να στεγνώσει αυθόρμητα σε κάθετο αέρα.

Αφού στεγνώσετε, τοποθετήστε 1 σταγόνα λαδιού βύθιση για να το παρατηρήσετε κάτω από το στόχο του 100X στο οπτικό μικροσκόπιο.

Βοηθητικό πρόγραμμα

Αυτή η τεχνική επιτρέπει τη διάκριση των μορφοτυπικών διαφορών των περισσότερων βακτηριδίων.

Οι μαγιά διακρίνονται επίσης από αυτό το χρώμα. Λαμβάνουν το κρύσταλλο ιώδες, δηλαδή, λεκιάζουν θετικά το Gram.

Από την άλλη πλευρά, μπορούν να διακριθούν βακτήρια που σχηματίζουν θετικά σπόρια Gram, στα οποία παρατηρείται ένας καθαρός χώρος μέσα στο βακίλο, όπου σχηματίστηκε το ενδοσπόριο, αν και τα σπόρια δεν λεκιάζουν καλά. Για τη χρήση σπόρων χρησιμοποιούνται άλλες τεχνικές όπως η Shaeffer-Fulton.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αυτός ο λεκές δεν χρησιμεύει για το χρωματισμό όλων των τύπων βακτηρίων, δηλαδή υπάρχουν περιπτώσεις στις οποίες η χρώση δεν λειτουργεί.

Σε αυτή την περίπτωση, μπορούν να αναφερθούν τα βακτήρια που στερούνται κυτταρικού τοιχώματος. Για παράδειγμα: γένος Mycoplasma, σφαιροπλάστες, Ureaplasma, L-μορφές και πρωτοπλάστες.

Επίσης λερώνει άσχημα βακτηρίδια με τοίχους πλούσιους σε μυκολικά οξέα, όπως Μυκοβακτηρίδια και ενδοκυτταρικά βακτήρια όπως ο Χλαμύδιας και η Ρικέτσια.

Είναι επίσης ανεπαρκής η χρώση των περισσότερων σπειροχολικών βακτηρίων.

Υπάρχουν βακτήρια του ίδιου γένους που μπορούν να παρατηρηθούν στο ίδιο δείγμα όπως το Gram θετικό και το Gram αρνητικό. Όταν συμβεί αυτό, ονομάζεται μεταβλητή κηλίδα Gram, η οποία μπορεί να οφείλεται σε αλλοίωση των θρεπτικών ουσιών, θερμοκρασία, pH ή συγκέντρωση ηλεκτρολυτών..

Συνηθισμένα λάθη

Πλύνετε υπερβολικά

Η υπερβολή στο βήμα αποχρωματισμού μπορεί να προκαλέσει την παρατήρηση ψευδώς αρνητικών κατά Gram μικροοργανισμών.

Μην περιμένετε αρκετό χρόνο ξήρανσης για να προσθέσετε το λάδι βύθισης:

Αυτό το σφάλμα προκαλεί το σχηματισμό λιπαρών μικκυλίων που δυσκολεύουν να παρατηρήσουν τις υπάρχουσες δομές. Αυτό συμβαίνει όταν το έλαιο συνδέεται με τα μόρια νερού που υπάρχουν στο επίχρισμα.

Αντιστρέψτε τη σειρά των αντιδραστηρίων:

Ένα σφάλμα όπως αυτό θα προκαλέσει Gram-αρνητικά βακτηρίδια να εμφανίσουν μωβ, δηλαδή, ψευδώς θετικά Gram.

Χρησιμοποιήστε παλαιές καλλιέργειες (στερεές ή υγρές):

Μπορεί να προκαλέσει Gram θετικά βακτήρια να λεκιάσουν το Gram αρνητικό (ψευδώς αρνητικό κατά Gram). Αυτό συμβαίνει επειδή στις παλαιές καλλιέργειες είναι πιθανό ότι υπάρχουν νεκρά ή αλλοιωμένα βακτηρίδια και κάτω από αυτές τις συνθήκες τα βακτήρια δεν συγκρατούν τον ιώδη κρύσταλλο.

Χρησιμοποιήστε πολύ παλιά λύση Lugol:

Με την πάροδο του χρόνου το lugol χάνει τις ιδιότητές του και το χρώμα του εξασθενίζει. Εάν χρησιμοποιηθεί το ήδη εκφυλισμένο αντιδραστήριο, δεν θα σταθεροποιηθεί καλά το κρύσταλλο ιώδες, επομένως υπάρχει η δυνατότητα απόκτησης μιας οπτικοποίησης μικροοργανισμών ψευδώς Gram αρνητικών.

Μπλε φόντο

Ένα σωστά αποχρωματισμένο φόντο θα είναι κόκκινο. Ένα μπλε φόντο δείχνει ότι ο αποχρωματισμός ήταν ανεπαρκής.

Αναφορές

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Μικροβιολογία Medical, 6η έκδοση McGraw-Hill, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ
2. Koneman Ε, Allen S, Janda W, Schreckenberger Ρ, Winn W. (2004). Μικροβιολογική διάγνωση. (5η έκδοση). Αργεντινή, Εκδοτική Panamericana S.A..
3. Forbes Β, Sahm D, Weissfeld Α. 2009. Μικροβιολογική διάγνωση της Bailey & Scott. 12 ed. Αργεντινή Πανamericana S.A Σύνταξη
4. Casas-Rincón G. 1994. Γενική Μυκολογία. 2η έκδοση Universidad Central de Venezuela, Εκδόσεις βιβλιοθήκης. Βενεζουέλα, Καράκας.
5. "Κηλίδωση Gram" Wikipedia, Η ελεύθερη εγκυκλοπαίδεια. 4 Οκτωβρίου 2018, 23:40 UTC. 9 Δεκεμβρίου 2018, 17:11. Λήψη από το es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Εγχειρίδιο ιατρικής μικροβιολογίας. 2η έκδοση, Βενεζουέλα: Διεύθυνση ΜΜΕ και δημοσιεύσεις του Πανεπιστημίου του Carabobo.
7. Lopez-Jácome L, Hernandez-Durán Μ, C Colin-Castro, Pena-Ortega S, G Ceron-González, F. Franco-Cendejas Βασικές χρωστικές στο εργαστήριο μικροβιολογίας. Έρευνα για την αναπηρία. 2014; 3 (1): 10-18.