Giemsa βάψιμο θεμέλιο, υλικά, τεχνική και χρήσεις



Το Giemsa λεκές είναι ένας τύπος χρώσης των κλινικών δειγμάτων, με βάση το μείγμα των οξέων και βασικών βαφών. Η δημιουργία του εμπνεύστηκε από το έργο του Romanowsky, όπου ο Gustav Giemsa, χημικός και βακτηριολόγος αρχικά από τη Γερμανία, το τελειοποίησε προσθέτοντας γλυκερόλη για να σταθεροποιήσει τις ενώσεις.

Οι αλλαγές που δημιουργήθηκαν στην αρχική τεχνική του Romanowsky επέτρεψαν να βελτιωθούν σημαντικά οι μικροσκοπικές παρατηρήσεις, επομένως η τεχνική βαφτίστηκε με το όνομα του χρώματος Giemsa.

Επειδή πρόκειται για μια απλή τεχνική για την εκτέλεση, ιδιαίτερα λειτουργική και οικονομική, χρησιμοποιείται σήμερα ευρέως στο κλινικό εργαστήριο για αιματολογικές κηλίδες, δείγματα μυελού των οστών και τμήματα ιστών..

Η τεχνική χρώσης Giemsa είναι πολύ χρήσιμη για κυτταρολογικές μελέτες, καθώς επιτρέπει την παρατήρηση ειδικών δομών των κυττάρων. Αυτή η τεχνική κηλιδώνει τα κυτταροπλάσματα, τους πυρήνες, τους πυρήνες, τα κενοτόπια και τους κόκκους των κυττάρων, που είναι σε θέση να διακρίνει ακόμη και τα καλά ίχνη χρωματίνης.

Επιπλέον, μπορούν να ανιχνευθούν σημαντικές μεταβολές στο μέγεθος, το σχήμα ή τον χρωματισμό του πυρήνα, όπου είναι δυνατόν να απεικονιστεί η απώλεια της σχέσης πυρήνα-κυτταρόπλασμα.

Από την άλλη πλευρά, επιτρέπει τον εντοπισμό ανώριμων κυττάρων στο μυελό των οστών και στο περιφερικό αίμα, που είναι σημαντικό για τη διάγνωση σοβαρών ασθενειών όπως η λευχαιμία. Είναι επίσης δυνατό να ανιχνευθούν αιμοπαράσιτα, επιπλέον και ενδοκυτταρικά βακτήρια, μύκητες, μεταξύ άλλων.

Στην κυτταρογενετική χρησιμοποιείται αρκετά, καθώς είναι δυνατόν να μελετηθεί η μίτωση των κυττάρων.

Ευρετήριο

  • 1 Βάση του χρωματισμού Giemsa
  • 2 Υλικά
    • 2.1 Υλικά για την παρασκευή του μητρικού διαλύματος
    • 2.2 Τρόπος προετοιμασίας του μητρικού διαλύματος
    • 2.3 Υλικά για την παρασκευή του ρυθμιστικού διαλύματος
    • 2.4 Τελική παρασκευή της χρωστικής ουσίας
    • 2.5 Πρόσθετα υλικά που απαιτούνται για την εκτέλεση του χρωματισμού
  • 3 Τεχνική
    • 3.1 Βαφή διαδικασία
  • 4 Βοηθητικά προγράμματα
    • 4.1 Αιματολογία
    • 4.2 Μυκητολογία
    • 4.3 Βακτηριολογία
    • 4.4 Παρασιτολογία
    • 4.5 Κυτταρολογία
    • 4.6 Κυτταρογενετική
  • 5 Έρευνες που αποδεικνύουν την αποτελεσματικότητα της χρώσης Giemsa
  • 6 Συστάσεις για καλές χρώσεις
  • 7 Συνηθισμένα λάθη στο χρωματισμό του Giemsa
    • 7.1 Εξαιρετικά μπλε χρώμα
    • 7.2 Υπερβολικά ροζ χρώμα
    • 7.3 Παρουσία κατακρημνισμάτων στο επίχρισμα
    • 7.4 Παρουσία μορφολογικών αντικειμένων
  • 8 Κατάσταση αποθήκευσης
  • 9 Αναφορές

Ίδρυση του χρωματισμού Giemsa

Οι χρωστικές τύπου Romanowsky βασίζονται στη χρήση αντιθέσεων ανάμεσα σε οξέα και βασικές βαφές, για να επιτευχθεί χρώση των βασικών και όξινων δομών, αντίστοιχα. Όπως μπορεί να φανεί, υπάρχει μια συνάφεια των βαφών οξέος για τη βαφή των βασικών δομών και αντίστροφα.

Η βασική βαφή που χρησιμοποιείται είναι το κυανό του μεθυλενίου και τα οξειδωμένα παράγωγά του (Azure Α και Azure Β), ενώ η βαφή οξέος είναι η ηωσίνη.

Οι όξινες δομές των κυττάρων είναι τα νουκλεϊνικά οξέα, οι κόκκοι των τεμαχισμένων βασεόφιλων, μεταξύ άλλων, επομένως θα βαφούν με κυανό του μεθυλενίου.

Με την ίδια έννοια, οι βασικές δομές των κυττάρων είναι η αιμοσφαιρίνη και μερικοί κόκκοι όπως αυτοί που περιέχονται στα τεταμένα ηωσινόφιλα, μεταξύ άλλων. αυτά θα βαφούν με ηωσίνη.

Από την άλλη πλευρά, λόγω του γεγονότος ότι το κυανό του μεθυλενίου και το γαλάζιο χαρακτηρίζονται από μεταχρωματικές βαφές, μπορούν να παρέχουν μεταβλητό τόνο στις διάφορες δομές ανάλογα με το φορτίο των πολυανιόντων που κατέχουν..

Έτσι, η στρατηγική συνδυασμού όξινων και βασικών βαφών είναι σε θέση να αναπτύξει ένα ευρύ φάσμα χρωμάτων, σύμφωνα με τα βιοχημικά χαρακτηριστικά της κάθε δομής, βηματοδότηση ανοιχτό μπλε σκούρο μπλε αποχρώσεις, μωβ και μωβ στην περίπτωση των δομών οξέος.

Ενώ ο χρωματισμός που παρέχεται από την ηωσίνη είναι πιο σταθερός, δημιουργώντας χρώματα ανάμεσα σε κοκκινωπό πορτοκαλί και σολομό.

Υλικά

Υλικά για την παρασκευή του μητρικού διαλύματος

Η παρασκευή του αποθεματικού διαλύματος απαιτεί ζύγιση 600 mg κονιοποιημένης χρωστικής Giemsa, με μέτρηση 500 cm3 μεθυλικής αλκοόλης χωρίς ακετόνη και 50 cm3 ουδέτερης γλυκερίνης.

Τρόπος προετοιμασίας του μητρικού διαλύματος

Τοποθετήστε τη βαριά σκόνη Giemsa σε κονίαμα. Εάν υπάρχουν σβώλοι, πρέπει να ψεκάζονται. Ακολούθως προσθέστε μια αξιοσημείωτη ποσότητα της μετρημένης γλυκερίνης και αναμίξτε πολύ καλά. Το ληφθέν μίγμα χύνεται σε πολύ καθαρή φιάλη κεχριμπαριού.

Η υπόλοιπη γλυκερίνη τοποθετείται στο κονίαμα. Ανακατέψτε ξανά για να καθαρίσετε την υπόλοιπη βαφή που έχει κολλήσει στους τοίχους του κονιάματος και ρίξτε μέσα στο ίδιο μπουκάλι.

Το φιαλίδιο καλύπτεται και μεταφέρεται για 2 ώρες σε υδατόλουτρο στους 55 ° C. Ενώ βρίσκεστε σε ένα λουτρό bain-marie, ανακατέψτε ελαφρά το μείγμα κάθε μισή ώρα ή έτσι.

Στη συνέχεια, το μίγμα αφήνεται να ψυχθεί για να τοποθετηθεί η αλκοόλη. Προηγουμένως, ένα μέρος της μετρούμενης αλκοόλης τοποθετείται στο κονίαμα για να τελειώσει το πλύσιμο ό, τι έχει απομείνει από τη βαφή και στη συνέχεια προστίθεται στο μίγμα μαζί με το υπόλοιπο αλκοόλ.

Αυτό το παρασκεύασμα θα πρέπει να επιτρέπεται να ωριμάσει για τουλάχιστον 2 εβδομάδες. Το τμήμα που χρησιμοποιείται για το μητρικό διάλυμα πρέπει να φιλτραριστεί.

Για να αποφύγετε τη μόλυνση του σκευάσματος, συνιστάται να περάσετε το τμήμα που θα χρησιμοποιείται συνεχώς σε μια μικρή φιάλη κεχριμπαριού με σταγονόμετρο. Επαναφορτίζετε κάθε φορά που εξαντλείται το αντιδραστήριο.

Υλικά για την παρασκευή του ρυθμιστικού διαλύματος

Από την άλλη πλευρά, ένα ρυθμιστικό διάλυμα σε ρΗ 7.2 παρασκευάζεται ως εξής:

Λαμβάνονται 6,77 γραμμάρια φωσφορικού νατρίου (άνυδρο) (NaHPO4), 2,59 g δισόξινου φωσφορικού καλίου (ΚΗ)2PO4) και απεσταγμένο νερό μέχρι 1000 cc.

Τελική παρασκευή της βαφής

Για την παρασκευή του τελικού διαλύματος χρώσης, μετρώνται 2 κ.εκ. του διηθημένου αποθέματος διαλύματος και αναμιγνύονται με 6 κ.εκ. του ρυθμιστικού διαλύματος. Το μίγμα αναδεύεται.

Ένα σημαντικό γεγονός που πρέπει να ληφθεί υπόψη είναι ότι οι τεχνικές παρασκευής της βαφής μπορούν να αλλάξουν σύμφωνα με το εμπορικό σπίτι.

Πρόσθετα υλικά που απαιτούνται για την εκτέλεση του χρωματισμού

Εκτός από τα υλικά που περιγράφονται, θα πρέπει να παρέχονται χρωματικές γέφυρες, οθόνες νερού ή ενυδρείο για πλύσιμο, φύλλα για αντικείμενα ή καλύμματα, χρονόμετρο για τον έλεγχο των χρόνων χρωματισμού και χαρτί που χρωματίζει ή κάποιο υλικό που μπορεί να στεγνώσει ( γάζα ή βαμβάκι).

Τεχνική

Βαφή διαδικασία

1) Πριν από το χρωματισμό, πρέπει να έχετε το δείγμα απλωμένο σε μια καθαρή ολίσθηση..

Τα δείγματα μπορούν να είναι αίμα, μυελός των οστών, τεμάχια ιστολογικών ιστών ή δείγματα του κόλπου-κόλπου. Συνιστάται οι εξωτερικές επιφάνειες να είναι λεπτές και να έχουν 1 ή 2 ώρες ξήρανσης πριν τους χρωματίσει.

2) Όλα τα φύλλα που πρέπει να χρωματίσετε τοποθετούνται σε έγχρωμη γέφυρα. Πάντα να εργάζεστε με την ίδια σειρά και να εντοπίζετε κάθε φύλλο καλά.

3) Τοποθετήστε μερικές σταγόνες 100% μεθυλικής αλκοόλης (μεθανόλη) στο επίχρισμα και αφήστε για 3 έως 5 λεπτά, για να διορθώσετε και να αφυδατώσετε το δείγμα.

4) Απορρίψτε τη μεθανόλη που υπάρχει στο φύλλο και αφήστε την να στεγνώσει στον αέρα.

5) Μόλις στεγνώσει, τοποθετήστε το τελικό διάλυμα χρώσης με ένα σταγονόμετρο μέχρι να καλύψει ολόκληρο το φύλλο. Αφήστε το για 15 λεπτά. Μερικοί συντάκτες προτείνουν έως και 25 λεπτά. Εξαρτάται από το εμπορικό σπίτι.

6) Αποστραγγίστε τη βαφή και πλύνετε το επίχρισμα με απεσταγμένο νερό ή με διάλυμα ρυθμιστικού διαλύματος 7,2.

7) Σε ένα χαρτί που χρωματίζει αφήστε τα φύλλα να στεγνώσουν στον αέρα, τοποθετημένα κάθετα με τη βοήθεια ενός στηρίγματος.

8) Σκουπίστε το πίσω μέρος της αντικειμενοφόρου πλάκας με γάζα ή βαμβακερό βούρτσα που έχει υγρανθεί με αλκοόλη για να αφαιρέσετε τυχόν υπόλοιπες χρωστικές ουσίες.

Βοηθητικά προγράμματα

Η τεχνική χρώσης Giemsa χρησιμοποιείται σε διάφορους τομείς, όπως: αιματολογία, μυκολογία, βακτηριολογία, παρασιτολογία, κυτταρολογία και κυτταρογενετική.

Αιματολογία

Είναι η πιο συχνή χρησιμότητα που δίνεται σε αυτή τη χρώση. Με αυτό, μπορούμε να προσδιορίσουμε κάθε ένα από τα κύτταρα που υπάρχουν σε δείγματα μυελού των οστών ή περιφερικό αίμα. Εκτός από την εκτίμηση του αριθμού κάθε σειράς, η δυνατότητα ανίχνευσης λευκοκυττάρωσης ή λευκοπενίας, θρομβοπενίας, κλπ..

Επειδή είναι ευαίσθητη στην ταυτοποίηση ανώριμων κυττάρων, είναι σημαντική στη διάγνωση οξείας ή χρόνιας λευχαιμίας. Είναι επίσης δυνατή η διάγνωση της αναιμίας, όπως η δρεπανοκυτταρική ασθένεια, η δρεπανοκυτταρική νόσο, μεταξύ άλλων..

Μυκολογία

Σε αυτόν τον τομέα είναι κοινό να το χρησιμοποιήσετε για να αναζητήσετε Histoplasma capsulatum (ενδοκυτταρικός διμορφικός μύκητας) σε δείγματα ιστών.

Βακτηριολογία

Σε αιματολογικές κηλίδες που είναι χρωματισμένες με Giemsa είναι δυνατό να εντοπιστούν Borrelias sp σε ασθενείς που έχουν την ασθένεια που ονομάζεται πυρετός recurrentis. Οι σπειροχαιτίες είναι άφθονοι μεταξύ των ερυθροκυττάρων, σε δείγματα που λαμβάνονται στην πυρετό κορυφή.

Είναι επίσης δυνατή η απεικόνιση των ενδοκυτταρικών βακτηρίων ως Rickettsias sp και Chlamydia trachomatis σε μολυσμένα κύτταρα.

Παρασιτολογία

Στον τομέα της παρασιτολογίας, η χρώση Giemsa επέτρεψε τη διάγνωση παρασιτικών ασθενειών όπως η ελονοσία, η νόσος Chagas και η λεϊσμανίαση..

Στα δύο πρώτα τα παράσιτα Plasmodium sp και το Trypanosoma cruzi αντίστοιχα μπορούν να εμφανιστούν στο περιφερικό αίμα των μολυσμένων ασθενών, μπορούν να βρεθούν σε διαφορετικά στάδια σύμφωνα με τη φάση στην οποία η ασθένεια είναι.

Για να βελτιωθεί η αναζήτηση παρασίτων αίματος, συνιστάται η χρήση λεκέδων Giemsa που αναμιγνύονται με τη βαφή May-Grünwald.

Παρομοίως, η δερματική λεϊσμανίαση μπορεί να διαγνωστεί κατά την αξιολόγηση δειγμάτων βιοψιών του δέρματος που χρωματίζονται με Giemsa, όπου βρίσκεται το παράσιτο.

Κυτταρολογία

Η χρώση Giemsa χρησιμοποιείται επίσης για την κυτταρολογική μελέτη ενδοκυτταρικών δειγμάτων, αν και δεν είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη τεχνική για το σκοπό αυτό.

Αλλά σε περιπτώσεις σπανιότητας των πόρων μπορεί να χρησιμοποιηθεί, έχοντας μια λειτουργικότητα παρόμοια με αυτή που προσφέρει η τεχνική Papanicolaou και με χαμηλότερο κόστος. Ωστόσο, απαιτείται εμπειρογνωμοσύνη εκ μέρους του εξεταστή.

Κυτταρογενετική

Ένα σχετικό χαρακτηριστικό της χρώσης Giemsa είναι η ικανότητά της να δεσμεύεται ισχυρά σε περιοχές πλούσιες σε αδενίνες DNA και θυμίνες. Αυτό επιτρέπει στο DNA να οπτικοποιηθεί κατά τη διάρκεια της μίτωσης των κυττάρων, σε διαφορετικές καταστάσεις συμπύκνωσης.

Αυτές οι μελέτες είναι απαραίτητες για την ανίχνευση χρωματικών παρεκκλίσεων, όπως οι επαναλήψεις, διαγραφές ή μετατοπίσεις των διαφορετικών περιοχών των χρωμοσωμάτων..

Έρευνες που αποδεικνύουν την αποτελεσματικότητα της χρώσης Giemsa

Οι Cannova et al (2016), συνέκριναν 3 τεχνικές χρωματισμού για τη διάγνωση της δερματικής λεϊσμανίασης.

Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποίησαν δείγματα που ελήφθησαν από πειραματόζωα (Mesocrisetus auratus) πειραματικά εμβολιασμένο με Leishmanias.

Οι συγγραφείς κατέδειξαν ότι η χρώση Giemsa ήταν καλύτερη από την χρώση Pap-mart® και Gaffney. Ως εκ τούτου, έκριναν ότι η κηλίδα Giemsa είναι ιδανική για τη διάγνωση της δερματικής λεϊσμανίασης.

Τα άριστα αποτελέσματα που λαμβάνονται από τους συγγραφείς είναι λόγω του συνδυασμού των βαφών που συνθέτουν το μίγμα της Giemsa παρουσιάζει τα αναγκαία για τη δημιουργία ευνοϊκού αντίθεση συνθήκες, επιτρέποντας σαφείς δομές διάκριση μη-μαστιγοφόρων εντός και εξωκυτταρικά.

Οι άλλες τεχνικές (Pap-mart® και Gaffney) το έκαναν επίσης, αλλά με έναν πιο αδύναμο τρόπο και επομένως πιο δύσκολο να απεικονιστούν. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο η χρώση Giemsa συνιστάται για την παρασιτολογική διάγνωση της λεϊσμανίασης.

Ομοίως, μια μελέτη από Ramirez et al (1994) αξιολόγησε την εγκυρότητα των Giemsa και Lendrum σε επιπεφυκότα επιχρίσματα για την ταυτοποίηση Chlamydia trachomatis.

Οι συγγραφείς διαπίστωσαν ότι η χρώση Giemsa και Ledrum έχει την ίδια ιδιαιτερότητα, αλλά η Giemsa ήταν πιο ευαίσθητη.

Αυτό εξηγεί γιατί σήμερα η χρώση Giemsa είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη για τη διάγνωση των λοιμώξεων από χλαμύδια, ειδικά αν υπάρχουν λίγοι πόροι.

Συστάσεις για καλές χρώσεις

Η ξήρανση των φύλλων δεν πρέπει να επιταχυνθεί. Ο χρόνος προληπτικής εποπτείας πρέπει να περιμένει για την ξήρανσή του στον ανοιχτό αέρα. Περίπου 2 ώρες.

Χρώμα αμέσως μετά από 2 ώρες για καλύτερα αποτελέσματα.

Για να στερεωθούν τα επιχρίσματα και να λεκιασθούν καλύτερα, το δείγμα πρέπει να διανεμηθεί στο φύλλο κατά τρόπο ώστε να παραμένει ένα λεπτό και ομοιόμορφο στρώμα.

Το προτιμώμενο δείγμα είναι τριχοειδές αίμα, όπως το επίχρισμα γίνεται απευθείας από την σταγόνα αίματος και ως εκ τούτου το δείγμα δεν φέρει καμία πρόσθετο, το οποίο προάγει τη διατήρηση των κυτταρικών δομών.

Ωστόσο, αν χρησιμοποιείται φλεβικό αίμα, το EDTA θα πρέπει να χρησιμοποιείται ως αντιπηκτικό και όχι ως ηπαρίνη, καθώς το τελευταίο συνήθως παραμορφώνει τα κύτταρα.

Συνηθισμένα λάθη στο χρωματισμό του Giemsa

Στην πρακτική αυτού του χρωματισμού, μπορούν να γίνουν λάθη. Αποδεικνύονται από ξαφνικές αλλαγές στις αποχρώσεις των δομών.

Εξαιρετικά μπλε χρώμα

Μπορεί να οφείλεται σε:

  • Πολύ χοντρά κηλίδες
  • Υπέρβαση του χρόνου χρώσης
  • Πάρα πολύ πλύσιμο.
  • Χρήση αντιδραστηρίων πολύ πάνω από το ουδέτερο pH (αλκαλικό).

Υπό αυτές τις συνθήκες τα χρώματα από τις ακόλουθες δομές παραμορφωμένη, έτσι ώστε ερυθροκύτταρα αντί βαμμένα ροζ-σολομός θα είναι πράσινο, οι κόκκοι των ηωσινοφίλων που θα πρέπει να χρωματίζονται κόκκινο τούβλο γαλαζωπό ή γκρι θα γυρίσει και ούτω καθεξής βούληση απόκλιση στους συνήθεις τόνους.

Υπερβολικά ροζ χρώμα

Μπορεί να οφείλεται σε:

  • Ανεπαρκής χρόνος χρώσης.
  • Παρατεταμένο ή υπερβολικό πλύσιμο.
  • Κακή ξήρανση.
  • Χρήση πολύ όξινων αντιδραστηρίων.

Σε αυτή τη συγκεκριμένη περίπτωση, οι δομές που είναι συνήθως χρωματισμένες μπλε δεν θα είναι σχεδόν ορατές, ενώ οι δομές που είναι χρωματισμένες ροζ θα έχουν πολύ υπερβολικούς τόνους.

Παράδειγμα: ερυθροκύτταρα λάβει μια ισχυρή έντονο κόκκινο ή πορτοκαλί χρώμα, η πυρηνική χρωματίνη θα απαλό ροζ και κοκκία των ηωσινοφίλων χρωματισμένο έντονο ερυθρό έντονη.

Παρουσία κατακρημνισμάτων στο επίχρισμα

Οι αιτίες μπορεί να είναι:

  • Χρησιμοποιήστε βρώμικα ή κακώς πλυμένα φύλλα.
  • Μην αφήνετε το επίθεμα να στεγνώσει καλά.
  • Αφήστε το διάλυμα στερέωσης για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα.
  • Ανεπαρκής πλύση στο τέλος της χρώσης.
  • Ανεπαρκής διήθηση ή μη φιλτράρισμα της χρωστικής που χρησιμοποιείται.

Παρουσία μορφολογικών αντικειμένων

Μπορούν να εμφανιστούν μορφολογικά αντικείμενα στα επιχρίσματα, καθιστώντας δύσκολη την οπτικοποίηση και ερμηνεία των υφιστάμενων δομών. Αυτό οφείλεται:

  • Τύπος αντιπηκτικού που χρησιμοποιείται, όπως η ηπαρίνη.
  • Χρήση βρώμικων, κατεστραμμένων ή λιπαρών φύλλων.

Τρόπος αποθήκευσης

Μετά την προετοιμασία, η βαφή πρέπει να διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου (15 - 25 ° C), για να αποφευχθεί η καθίζηση της χρωστικής ουσίας. Πρέπει να φυλάσσεται σε δοχείο κλειστού πορτοκαλί.

Αναφορές

  1. Cannova D, Brito Ε και Simons Μ. Αξιολόγηση τεχνικών χρωματισμού για τη διάγνωση της δερματικής λεϊσμανίασης. Σάλους.  2016; 20 (2): 24-29.
  2. PanReac Εφαρμογή αντιδραστηρίων ITW. Giemsa λεκές. Έκδοση 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Ισπανία.
  3. Clark G. Procedures staining (1981), 4thhed. Williams & Willkins.
  4. Εφαρμοσμένη Κλινική Χημεία Χρωστική Giemsa για διάγνωση in vitro. Διανομέας: cromakit.es
  5. Ramirez R, Mejia M, Garcia de la Riva J, F και Hermes Grazioso C. Ισχύς Giemsa και Lendrum σε επιχρίσματα του επιπεφυκότα για ταυτοποίηση Chlamydia trachomatis. Bol της Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
  6. Casas-Rincon G. Γενική Μυκολογία. 1994. 2nd Ed. Universidad Central de Venezuela, Εκδόσεις βιβλιοθήκης. Βενεζουέλα, Καράκας.
  7. "Χρώμα Giemsa." Wikipedia, Η ελεύθερη εγκυκλοπαίδεια. 1 Σεπ 2017, 01:02 UTC. 6 Δεκεμβρίου 2018, en.wikipedia.org.