Spore γονιδίων, τεχνικές και χρήσεις

Το κηλίδωση σπορίων είναι η μεθοδολογία που χρησιμοποιείται για το χρωματισμό των δομών ανθεκτικότητας που σχηματίζουν κάποια βακτηριακά γένη όταν βρίσκονται σε δυσμενείς συνθήκες. αυτές οι δομές αντιστοιχούν σε έναν τρόπο επιβίωσης.

Υπάρχουν πολλά γένη που σχηματίζουν σπόρια. Ωστόσο, οι κύριοι είναι ο Bacillus και το Clostridium. Αυτά τα γένη θεωρούνται πιο συναφή επειδή έχουν παθογόνα είδη για τον άνθρωπο.

Κάθε μπακίλλος μπορεί να προκαλέσει ένα σπόριο. Κατά την προετοιμασία βαφής, ο σπορίων μπορεί να βρεθεί εντός του βακίλου (ενδοσπόρια) ή εκτός αυτής (exospora). Με συμβατικές τεχνικές βαφής για βακτήρια - όπως βαφή Gram - τα σπόρια παραμένουν άχρωμα.

Επί του παρόντος, υπάρχουν αρκετές μεθοδολογίες χρωματισμού που είναι σε θέση να διασχίσουν τη χοντρή δομή του σπορίου για να την βαφή. Αυτές οι μεθοδολογίες είναι πολύ ποικίλες. Μεταξύ αυτών μπορούν να αναφερθούν η τεχνική Dorner, χρώση Möeller και τη μεθοδολογία Shaeffer-Fulton, επίσης γνωστή ως Wirtz-Conklin.

Από όλες τις αναφερόμενες τεχνικές, η μεθοδολογία Shaeffer-Fulton είναι η πλέον χρησιμοποιούμενη σε εργαστήρια ρουτίνας. Χάρησε το όνομά της σε δύο μικροβιολόγους που δημιούργησαν τον χρωματισμό το 1930: Alicia Shaeffer και MacDonald Fulton. Ωστόσο, μερικές φορές η τεχνική ονομάζεται Wirtz-Conklin προς τιμή δύο βακτηριολόγων της δεκαετίας του 1900.

Ευρετήριο

• 1 Ίδρυμα
• 2 Τεχνικές χρωματισμού σπορίων
  • 2.1 Η τεχνική του Dorner
  • 2.2 Τροποποιημένη τεχνική Dorner
  • 2.3 Τεχνική του Shaeffer-Fulton ή Wirtz-Conklin
  • 2.4 Τεχνική Möeller
  • 2.5 Τροποποιημένη τεχνική Möeller χωρίς θερμότητα
• 3 Χρήσεις
  • 3.1 Παραδείγματα
• 4 Αναφορές

Ίδρυμα

Τα σπόρια δεν λεκιάζουν με συμβατικούς χρωματισμούς επειδή έχουν πολύ πυκνό τοίχωμα. Η σύνθετη σύνθεση των σπόρων εμποδίζει την είσοδο των περισσότερων βαφών.

Εάν ο σπορίων έξω στη μελέτη τα ακόλουθα στρώματα παρατηρούνται: πρώτο είναι η exosporium, η οποία είναι η λεπτή εξωτερική στρώση που σχηματίζεται από γλυκοπρωτεΐνες.

Στη συνέχεια έρχεται η επιδερμίδα, η οποία παρέχει αντίσταση σε υψηλές θερμοκρασίες, ακολουθούμενη από τον φλοιό που αποτελείται από πεπτιδογλυκάνη. Στη συνέχεια υπάρχει ο τοίχος της βάσης που προστατεύει τον πρωτοπλάστη.

Το σπόριο είναι μια αφυδατωμένη δομή που περιέχει 15% ασβέστιο και διπικολινικό οξύ. Επομένως, οι περισσότερες τεχνικές χρωματισμού σπορίων βασίζονται στην εφαρμογή της θερμότητας έτσι ώστε η βαφή να μπορεί να διεισδύσει στην παχιά δομή.

Μόλις το σπόριο είναι βαμμένο, δεν μπορεί να αποβάλει τη βαφή. Στην τεχνική Shaeffer-Fulton πράσινου μαλαχίτη εισέρχεται φυτικά κύτταρα και, με εφαρμογή θερμότητας, διαπερνά το ενδοσπόρια και επίσης σε exosporas.

Όταν πλένεται με νερό, η βαφή αφαιρείται από το φυτικό κύτταρο. Αυτό συμβαίνει επειδή η πράσινη βαφή μαλαχίτη είναι ελαφρώς βασική, επομένως δεσμεύεται ασθενώς στο βλαστικό κύτταρο.

Από την άλλη πλευρά, δεν μπορεί να βγει από το σπόριο και τέλος ο μπακίλλος με τη σαφαρανίνη αντιπαραβάλλεται. Αυτό το θεμέλιο ισχύει για τις υπόλοιπες τεχνικές, στις οποίες συμβαίνει κάτι παρόμοιο.

Τεχνικές χρωματισμού σπορίων

Για να κάνετε τα σπόρια λεκέ, πρέπει να έχετε μια καθαρή κουλτούρα του ύποπτου στελέχους που θέλετε να μελετήσετε.

Η καλλιέργεια υποβάλλεται σε ακραίες θερμοκρασίες για 24 ώρες για να διεγείρει τον μικροοργανισμό να σχηματίσει σπόρους. Για το σκοπό αυτό, η καλλιέργεια μπορεί να τοποθετηθεί σε κλίβανο στους 44 ° C ή σε ψυγείο (8 ° C) για 24 ή 48 ώρες.

Εάν παραμείνει πάρα πολύς χρόνος στις αναφερόμενες θερμοκρασίες, θα παρατηρηθούν μόνο εξωσπόρια, αφού όλα τα ενδοσπόρια θα έχουν αφήσει το βακίλλιο.

Στο τέλος του χρόνου, μερικές σταγόνες αποστειρωμένου φυσιολογικού διαλύματος θα πρέπει να τοποθετούνται σε μια καθαρή ολίσθηση. Στη συνέχεια ένα μικρό μέρος της καλλιέργειας λαμβάνεται και μια λεπτή εξάπλωση γίνεται. 

Στη συνέχεια αφήνεται να στεγνώσει, στερεώνεται στη θερμότητα και χρωματίζεται με μερικές από τις τεχνικές που εξηγούνται παρακάτω:

Η τεχνική του Dorner

1- Ετοιμάστε σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα ενός συμπυκνωμένου σπορώδεις εναιώρημα μικροοργανισμών σε απεσταγμένο νερό και πρόσθεσε ένα φουξίνη ίσο όγκο διηθείται Kinyoun.

2- Τοποθετήστε το σωληνάριο σε λουτρό με βραστό νερό για 5 έως 10 λεπτά.

3- Σε μια καθαρή ολίσθηση, αναμίξτε μια σταγόνα του προηγούμενου εναιωρήματος με μια σταγόνα υδατικού διαλύματος 10% nigrosine, βράστε και φιλτράρετε.

4- Επεκτείνετε και στεγνώστε γρήγορα με ήπια θερμότητα.

5- Εξετάστε με στόχο 100X (εμβάπτιση).

Τα σπόρια κηλιδώνονται κόκκινα και τα βακτηριακά κύτταρα εμφανίζονται σχεδόν άχρωμα σε σκούρο γκρι φόντο.

Τροποποιημένη τεχνική Dorner

1- Ένα εναιώρημα του σποριοποιημένου μικροοργανισμού απλώνεται σε μια ολίσθηση και στερεώνεται στη θερμότητα.

2- Το δείγμα καλύπτεται με ταινία διηθητικού χαρτιού στο οποίο προστίθεται φουκικίνη φαινοϊκού οξέος. Η βαφή θερμαίνεται για 5 έως 7 λεπτά με τη φλόγα του καυστήρα Bunsen μέχρι να δημιουργηθεί η απελευθέρωση ατμών. Στη συνέχεια αφαιρείται το χαρτί.

3- Πλύνετε το παρασκεύασμα με νερό και στη συνέχεια στεγνώστε με απορροφητικό χαρτί.

4- επίχρισμα είναι καλυμμένο με ένα λεπτό φιλμ νιγκροζίνη 10%, χρησιμοποιώντας ένα δεύτερο ολισθητήρα για να επεκτείνει ή να νιγκροζίνη βελόνα.

Ο χρωματισμός που λαμβάνεται από τα σπόρια και τα βακτηρίδια είναι ο ίδιος με αυτόν που περιγράφεται στην προγενέστερη τεχνική.

Τεχνική Shaeffer-Fulton ή Wirtz-Conklin

1- Κάντε μια λεπτή εξάπλωση με ένα εναιώρημα του σποριοποιημένου μικροοργανισμού σε μια ολίσθηση και στερεώστε το για να θερμανθεί.

2- Καλύψτε την ολίσθηση με ένα υδατικό διάλυμα 5% πράσινο μαλαχίτη (ένα χαρτί φίλτρου μπορεί να τοποθετηθεί στο φύλλο).

3. Θερμαίνετε στη φλόγα του καυστήρα Bunsen για να προκαλέσετε διαφυγή ατμού και αφαιρέστε τη φλόγα. Επαναλάβετε τη λειτουργία για 6 έως 10 λεπτά. Εάν κατά τη διάρκεια της διαδικασίας το μαλαχίτης πράσινο διάλυμα εξατμιστεί πάρα πολύ, μπορούν να προστεθούν περισσότερα.

4- Αφαιρέστε το φίλτρο χαρτιού (εάν τοποθετήθηκε) και πλύνετε με νερό.

5- Καλύψτε τα πλακίδια με 0,5% υδατικό διάλυμα σαφρανίνης για 30 δευτερόλεπτα (ορισμένες παραλλαγές της τεχνικής χρησιμοποιώντας 0.1% υδατική σαφρανίνη και το αφήνουμε για 3 λεπτά).

Με αυτή την τεχνική τα σπόρια είναι πράσινα και τα βακίλα είναι κόκκινα.

Έχει το μειονέκτημα ότι τα ενδοσπόρια των νέων καλλιεργειών δεν λεκιάζουν καλά, επειδή φαίνονται εξαιρετικά διαυγή ή άχρωμα. Για να αποφευχθεί αυτό, συνιστάται η χρήση καλλιεργειών 48 ωρών επώασης.

Τεχνική Möeller

1 - Καλύψτε το επίχρισμα με χλωροφόρμιο για 2 λεπτά.

2- Απορρίψτε το χλωροφόρμιο.

3- Καλύψτε με 5% χρωμικό οξύ για 5 λεπτά.

4 - Πλύνετε με αποσταγμένο νερό

5- Το φύλλο καλύπτεται με φουξίνη καρβόλης καρβολικής και εκτίθεται στη φλόγα ενός καυστήρα Bunsen έως ότου οι εκπομπές ατμών? τότε αφαιρείται από τη φλόγα για λίγα λεπτά. Η λειτουργία επαναλαμβάνεται μέχρι να φτάσει τα 10 λεπτά.

6. Πλύνετε με νερό.

7. Χρησιμοποιήστε οξινισμένη αιθανόλη (υδροχλωρική αλκοόλη) για να αποχρωματίσετε. Αφήνεται για 20 ή 30 δευτερόλεπτα.

8- Πλύνετε με αποσταγμένο νερό.

9- Αντιμετωπίστε το φύλλο με μπλε του μεθυλενίου για 5 λεπτά.

10- Πλένουμε με αποσταγμένο νερό.

11- Αφήνεται να στεγνώσει και το δείγμα λαμβάνεται υπό μικροσκόπιο.

Τα σπόρια φαίνονται κόκκινα και μπλε βακίλλια. Είναι σημαντικό να μην εισπνεύσετε τους ατμούς, επειδή είναι τοξικοί και μακροπρόθεσμα μπορεί να είναι καρκινογόνοι.

Τροποποιημένη τεχνική Möeller χωρίς θερμότητα

Το 2007, ο Hayama και οι συνεργάτες του δημιούργησαν μια τροποποίηση της τεχνικής Möeller. Μπορούν εξαλειφθεί το στάδιο της θέρμανσης της βαφής και να αντικατασταθεί με την προσθήκη 2 σταγόνων επιφανειοδραστικού Tergitol 7 ανά 10 ml διαλύματος φουξίνη καρβόλης-καρβόλης. Τα ίδια αποτελέσματα ελήφθησαν.

Χρησιμοποιεί

Χρωματισμός σπόρια παρέχει ένα πολύ πολύτιμο και χρήσιμο για πληροφορίες ταυτοποίησης του παθογόνου, δεδομένου ότι η παρουσία του ίδιου, το σχήμα, τη θέση εντός του βακίλου και τη δυνατότητα να παραμορφώνεται το βλαστικό κύτταρο ή όχι, είναι στοιχεία που μπορούν να καθοδηγήσουν το είδος που εμπλέκονται σε ένα συγκεκριμένο φύλο.

Σε αυτό το πλαίσιο, αξίζει να σημειωθεί ότι τα σπόρια μπορεί να είναι στρογγυλά ή ωοειδή, μπορούν να τοποθετηθούν στο κέντρο ή επίσης σε παρακεντρική, υποχωρητική ή τερματική θέση.

Παραδείγματα

- Clostridium difficile σχηματίζει ένα οβάλ σπόριο σε τελική θέση που παραμορφώνει το βακίλλιο.

- Το σπόριο του Clostridium τρίτο Είναι ωοειδές, δεν παραμορφώνει το βακίλο και βρίσκεται στο τερματικό επίπεδο.

- Το ενδοσπόριο του Clostridium tetani είναι τερματικό και παραμορφώνει το μπακίλλιο, δίνοντας την εμφάνιση ενός βαρελιού.

- Τα σπόρια του Clostridium botulinum, Γ. histolyticum, Γ. νέος και C. septicum είναι στρογγυλά ή υποτελικά ωοειδή και παραμορφώνουν το μπακίλλιο.

- Το ενδοσπόριο του Clostridium sordelli βρίσκεται στην κεντρική θέση, με ελαφρά παραμόρφωση.

Αναφορές

1. Hayama Μ, Oana Κ, Kozakai Τ, Umeda S, Fujimoto J, Ota Η, Kawakami Υ Πρόταση ενός απλουστευμένου τεχνική για χρώση βακτηριακά σπόρια χωρίς εφαρμογή θερμότητας-επιτυχής τροποποίηση της μεθόδου Moeller του. Eur J Med Res., 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Συμμετέχοντες στη Wikipedia. Moeller λεκές. Wikipedia, Η ελεύθερη εγκυκλοπαίδεια. 3 Νοεμβρίου 2018, 03:28 UTC. Διατίθεται στη διεύθυνση: en.wikipedia.org
3. Pérez R., Juárez M, Rodríguez (2011). Εργαστηριακό Εγχειρίδιο Μικροβιολογικών Τεχνικών. Τμήμα Βασικών Επιστημών Ακαδημία Μικροβιολογίας. Εθνικό Πολυτεχνείο.
4. "Ενδοσπόρια". Wikipedia, Η ελεύθερη εγκυκλοπαίδεια. 25 Φεβρουαρίου 2018, 10:20 UTC. 10 Ιαν. 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macias J και συνεργάτες. (2006). Προσωπικό Εργασίας της Αυτόνομης Κοινότητας της Extremadura. Ειδική ατζέντα τόμος IV. Συντάκτης MAD. Σεβίλλη-Ισπανία, σελ. 211-212.
6. Silva Μ, Garcia M, Corrales J, Ponce Ε (2006) ειδικός .Técnico εργαστήριο, η Υπηρεσία της Γαλικίας Υγείας (SERGAS). Ειδικός τόμος του αντικειμένου 2. Εκδότης MAD. Σεβίλλη-Ισπανία, σελ. 79-80.
7. Koneman Ε, Allen S, Janda W, Schreckenberger Ρ, Winn W. (2004). Μικροβιολογική διάγνωση. (5η έκδοση). Αργεντινή, Εκδοτική Panamericana S.A..
8. Forbes Β, Sahm D, Weissfeld Α. 2009. Μικροβιολογική διάγνωση της Bailey & Scott. 12 ed. Αργεντινή Πανamericana S.A Σύνταξη