Λειτουργίες και τύποι ενδονουκλεασών



Το ενδονουκλεάσες είναι ένζυμα που κόβουν τους δεσμούς φωσφοδιεστέρα που βρίσκονται μέσα στην νουκλεοτιδική αλυσίδα. Οι περιοριστικές θέσεις των ενδονουκλεασών είναι πολύ ποικίλες. Μερικά από αυτά τα ένζυμα κόβουν σχεδόν παντού το ϋΝΑ (δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ, το γενετικό μας υλικό), δηλαδή είναι μη συγκεκριμένα.

Αντίθετα, υπάρχει μια άλλη ομάδα ενδονουκλεασών που είναι πολύ συγκεκριμένη στην περιοχή ή την ακολουθία που πρόκειται να επιβάλουν ειδικούς φόρους κατανάλωσης. Αυτή η ομάδα ενζύμων είναι γνωστή ως ένζυμα περιορισμού και είναι πολύ χρήσιμη στη μοριακή βιολογία. Στην ομάδα αυτή έχουμε τα γνωστά ένζυμα BamHI, EcoRl και AluI.

Σε αντίθεση με τις ενδονουκλεάσες, υπάρχει ένας άλλος τύπος καταλυτικών πρωτεϊνών - οι εξωνουκλεάσες - οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για τη θραύση της φωσφοδιεστερικής σύνδεσης στο τέλος της αλυσίδας.

Ευρετήριο

  • 1 ενδονουκλεάσες περιορισμού
  • 2 Λειτουργίες και εφαρμογές περιοριστικών ενδοθηκών
    • 2.1 Πολυμορφισμός μήκους θραυσμάτων περιορισμού (RFLP)
  • 3 Τύποι περιοριστικών ενδονουκλεασών
    • 3.1 Τύπος Ι
    • 3.2 Τύπος II
    • 3.3 Τύπος III
    • 3.4 Τύπος IV
  • 4 Αναφορές

Περιοριστικές ενδονουκλεάσες

Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού ή τα ένζυμα περιορισμού είναι καταλυτικές πρωτεΐνες που είναι υπεύθυνες για την διάσπαση των δεσμών φωσφοδιεστέρα μέσα στην αλυσίδα του DNA σε πολύ συγκεκριμένες αλληλουχίες.

Αυτά τα ένζυμα μπορούν να αποκτηθούν σε πολλαπλές εταιρείες βιοτεχνολογίας και η χρήση τους είναι σχεδόν απαραίτητη στις τρέχουσες τεχνικές χειρισμού DNA.

Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού ονομάζονται χρησιμοποιώντας τα πρώτα γράμματα της διωνυμικής επιστημονικής ονομασίας του οργανισμού από τον οποίο προέρχονται, ακολουθούμενη από το στέλεχος (αυτό είναι προαιρετικό) και τελειώνει με την ομάδα των περιοριστικών ενζύμων στα οποία ανήκουν. Για παράδειγμα, τα Bam ΗΙ και Eco RI χρησιμοποιούνται ευρέως σε ενδονουκλεάσες.

Η περιοχή του ϋΝΑ που αναγνωρίζει το ένζυμο ονομάζεται θέση περιορισμού και είναι μοναδική σε κάθε ενδονουκλεάση, αν και διάφορα ένζυμα μπορεί να συμπίπτουν στις θέσεις περιορισμού. Αυτή η θέση γενικά αποτελείται από μία βραχεία παλινδρομική αλληλουχία μήκους περίπου 4 έως 6 ζευγών βάσεων, όπως η AGCT (για Alu Ι) και η GAATTC για το Eco RI.

Οι παλινδρομικές αλληλουχίες είναι αλληλουχίες οι οποίες, αν και διαβάζονται στην κατεύθυνση 5 'προς 3' ή 3 'προς 5', είναι ταυτόσημες. Για παράδειγμα, στην περίπτωση του Eco RI, η παλινδρομική ακολουθία είναι: GAATTC και CTTAAG.

Λειτουργίες και εφαρμογές περιοριστικών ενδοθηκών

Ευτυχώς για τους μοριακούς βιολόγους, τα βακτηρίδια έχουν αναπτύξει κατά τη διάρκεια της εξέλιξης μια σειρά ενδονουκλεασών περιορισμού που αποσπά το εσωτερικό γενετικό υλικό.

Στη φύση, αυτά τα ένζυμα έχουν εξελιχθεί - κατά πάσα πιθανότητα - ως ένα σύστημα βακτηριακής προστασίας κατά της εισβολής ξένων μορίων ϋΝΑ, όπως αυτά από τους φάγους.

Προκειμένου να γίνει διάκριση μεταξύ του ίδιου και του ξένου γενετικού υλικού, αυτές οι ενδονουκλεάσες περιορισμού μπορούν να αναγνωρίσουν ειδικές αλληλουχίες νουκλεοτιδίων. Έτσι, το DNA που δεν έχει αυτή την αλληλουχία μπορεί να παραμείνει ανενόχλητο μέσα στο βακτήριο.

Αντιθέτως, όταν η ενδονουκλεάση αναγνωρίζει τη θέση περιορισμού, δεσμεύεται στο DNA και το κόβει.

Οι βιολόγοι ενδιαφέρονται να μελετήσουν το γενετικό υλικό των ζωντανών όντων. Ωστόσο, το DNA αποτελείται από αρκετά εκατομμύρια ζεύγη βάσεων σε μήκος. Αυτά τα μόρια είναι εξαιρετικά μακρά και θα πρέπει να αναλύονται σε μικρά θραύσματα.

Για να επιτευχθεί αυτός ο στόχος, ενδονουκλεάσες περιορισμού ενσωματώνονται στα διάφορα πρωτόκολλα μοριακής βιολογίας. Για παράδειγμα, ένα μεμονωμένο γονίδιο μπορεί να συλληφθεί και να αναπαραχθεί για μελλοντική ανάλυση. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται "κλωνοποίηση" ενός γονιδίου.

Πολυμορφισμός μήκους θραυσμάτων περιορισμού (RFLP)

Οι πολυμορφισμοί μήκους θραυσμάτων περιορισμού αναφέρονται στο πρότυπο συγκεκριμένων νουκλεοτιδικών αλληλουχιών στο ϋΝΑ που οι ενδονουκλεάσες περιορισμού είναι ικανές να αναγνωρίζουν και να κόβουν.

Χάρη στην ιδιαιτερότητα των ενζύμων, κάθε οργανισμός χαρακτηρίζεται από ένα συγκεκριμένο μοτίβο κοπής στο DNA, που προέρχεται από θραύσματα μεταβλητών μηκών.

Τύποι περιοριστικών ενδονουκλεασών

Ιστορικά, οι ενδονουκλεάσες περιορισμού έχουν ταξινομηθεί σε τρεις τύπους ενζύμων, που χαρακτηρίζονται με ρωμαϊκούς αριθμούς. Τον τελευταίο χρόνο έχει περιγραφεί ένας τέταρτος τύπος ενδονουκλεάσης.

Τύπος Ι

Το πιο σημαντικό χαρακτηριστικό των ενδονουκλεασών τύπου Ι είναι ότι είναι πρωτεΐνες που σχηματίζονται από διάφορες υπομονάδες. Κάθε μία από αυτές λειτουργεί ως σύμπλεγμα απλής πρωτεΐνης και συνήθως έχει δύο υπομονάδες που ονομάζονται R, δύο M και ένα S.

Το τμήμα S είναι υπεύθυνο για την αναγνώριση της θέσης περιορισμού στο DNA. Η υπομονάδα R, από την άλλη πλευρά, είναι απαραίτητη για τη διάσπαση και το Μ είναι υπεύθυνο για την καταλυτική αντίδραση μεθυλίωσης.

Υπάρχουν τέσσερις υποκατηγορίες ενζύμων τύπου Ι, γνωστά με τα γράμματα Α, Β, Γ και Δ, τα οποία είναι κοινά χρήσιμα. Αυτή η ταξινόμηση βασίζεται στη γενετική συμπληρωματικότητα.

Τα ένζυμα τύπου Ι ήταν οι πρώτες ενδονουκλεάσες περιορισμού που ανακαλύφθηκαν και καθαρίστηκαν. Ωστόσο, τα πιο χρήσιμα στην μοριακή βιολογία είναι εκείνα του τύπου II που θα περιγραφούν στην επόμενη ενότητα.

Τύπος ΙΙ

Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού τύπου II αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες ϋΝΑ και πραγματοποιούν διάσπαση σε σταθερή θέση πλησίον μίας αλληλουχίας που παράγει 5 'φωσφορικά και 3' υδροξύλια. Τα ιόντα μαγνησίου απαιτούνται συνήθως ως συμπαράγοντες (Mg2+), αλλά υπάρχουν κάποιες που έχουν πολύ πιο συγκεκριμένες απαιτήσεις.

Δομικά, μπορούν να εμφανιστούν ως μονομερή, διμερή ή ακόμα και τετραμερή. Η ανασυνδυασμένη τεχνολογία χρησιμοποιεί ενδονουκλεάσες τύπου II και γι 'αυτό έχουν χαρακτηριστεί περισσότερα από 3.500 ένζυμα.

Τύπος ΙΙΙ

Αυτά τα ενζυμικά συστήματα αποτελούνται από δύο γονίδια, που ονομάζονται mod και res, που κωδικοποιεί για υπομονάδες που αναγνωρίζουν το DNA και για τροποποιήσεις ή περιορισμούς. Και οι δύο υπομονάδες είναι απαραίτητες για τον περιορισμό, μια διαδικασία που εξαρτάται απόλυτα από την υδρόλυση του ΑΤΡ.

Για τη διάσπαση του μορίου DNA, το ένζυμο πρέπει να αλληλεπιδράσει με δύο αντίγραφα της μη παλινδρομικής αλληλουχίας αναγνώρισης και οι θέσεις πρέπει να είναι με αντίστροφο προσανατολισμό στο υπόστρωμα. Η διάσπαση προηγείται από μια μετατόπιση του DNA.

Τύπος IV

Μια πρόσθετη ομάδα έχει εντοπιστεί τελευταία. Το σύστημα αποτελείται από δύο ή περισσότερα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που διασπούν μόνο τροποποιημένες αλληλουχίες ϋΝΑ, είτε είναι μεθυλιωμένες, υδροξυμεθυλιωμένες ή υδροξυλιωμένες γλυκοσυλικές.

Για παράδειγμα, το ένζυμο EckKMcrBC αναγνωρίζει δύο δινουκλεοτίδια της γενικής μορφής RmC. μια πουρίνη που ακολουθείται από μια μεθυλιωμένη κυτοσίνη, η οποία μπορεί να διαχωριστεί με αρκετά ζεύγη βάσεων - από 40 έως σχεδόν 3000. Η διάσπαση γίνεται περίπου 30 ζεύγη βάσεων μετά την τοποθεσία που αναγνωρίζει το ένζυμο.

Αναφορές

  1. Burrell, Μ. Μ. (Ed.). (1993). Ένζυμα της μοριακής βιολογίας. Totowa, NJ: Humana Press.
  2. Loenen, W. Α., Dryden, D. Τ., Raleigh, Ε. Α., & Wilson, G. G. (2013). Ενζύματα περιορισμού τύπου Ι και συγγενείς τους. Έρευνα νουκλεϊκών οξέων, 42(1), 20-44.
  3. Murray, Ρ.Ρ., Rosenthal, Κ. S., & Pfaller, Μ.Α. (2017). Ιατρική Μικροβιολογία + StudentConsult στα ισπανικά + StudentConsult. Elsevier Health Sciences.
  4. Nathans, D., & Smith, Η. Ο. (1975). Περιοριστικές ενδονουκλεάσες στην ανάλυση και αναδιάρθρωση μορίων ϋΝΑ. Ετήσια επισκόπηση της βιοχημείας, 44(1), 273-293.
  5. Pingoud, Α., Fuxreiter, Μ., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Ενδονουκλεάσες περιορισμού τύπου II: δομή και μηχανισμός. Κυτταρικές και μοριακές βιοεπιστήμες, 62(6), 685.