Θρεπτικό υπόστρωμα ουρίας ουρίας, προετοιμασία και χρήσεις

Το ουρίας είναι ένα υγρό μέσο καλλιέργειας, που χρησιμοποιείται για να αποδείξει την παρουσία του ενζύμου ουρεάση σε ορισμένους μικροοργανισμούς. Η ουρεάση είναι ένα μικροβιακό ένζυμο που παράγεται συστατικά, δηλαδή συντίθεται ανεξάρτητα από το εάν το υπόστρωμα στο οποίο δρα.

Η λειτουργία της ουρεάσης σχετίζεται με την αποσύνθεση των οργανικών ενώσεων. Όλοι οι μικροοργανισμοί δεν είναι σε θέση να συνθέσουν αυτό το ένζυμο, επομένως η απόφασή του στο εργαστήριο επιτρέπει την αναγνώριση ορισμένων βακτηριακών στελεχών και ακόμη και τη διαφοροποίηση μεταξύ ειδών του ίδιου γένους..

Υπάρχουν δύο τύποι τεστ ουρίας: Stuart και Christensen. Διαφέρουν ως προς τη σύνθεση και την ευαισθησία τους. Το πρώτο είναι ειδικό για να δείξει μια μεγάλη ποσότητα ουρεάσης που παράγεται από είδη του γένους Proteus.

Το δεύτερο είναι πιο ευαίσθητο και μπορεί να ανιχνεύσει μικρές ποσότητες ουρεάσης καθυστερημένα παράγεται από άλλες βακτηριακές, όπως Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, και Helicobacter γένη Mycobacterium.

Stuart ζωμό ουρία περιλαμβάνει ουρία, χλωριούχο νάτριο, όξινο φωσφορικό κάλιο, φωσφορικό μονοκάλιο, εκχύλισμα ζύμης, ερυθρό φαινόλης και αποσταγμένο νερό.

Ενώ, ο ζωμός ή άγαρ ουρίας Christensen του αποτελείται από πεπτόνη, χλωριούχο νάτριο, φωσφορικό μονοκάλιο, γλυκόζη, ουρία, ερυθρό φαινόλης, αποσταγμένο νερό και άγαρ. Ο τελευταίος μόνον αν είναι το στερεό μέσο.

Ευρετήριο

• 1 Ίδρυμα
  • 1.1 ζωμός ουρίας Stuart
  • 1.2 ζωμός Christensen ή ουρία άγαρ
  • 1.3 Ερμηνεία και των δύο μέσων (Stuart και Christensen)
• 2 Προετοιμασία
  • 2.1 ζωμός ουρίας Stuart
  • 2.2 ζωμό Christensen ή ουρία άγαρ
• 3 Χρήσεις
• 4 Σπορά της δοκιμής ουρίας
• 5 Έλεγχος ποιότητας
• 6 Αναφορές

Ίδρυμα

Το ένζυμο ουρεάση υδρολύει την ουρία για να σχηματίσει διοξείδιο του άνθρακα, νερό και δύο μόρια αμμωνίας. Αυτές οι ενώσεις αντιδρούν για να σχηματίσουν το τελικό προϊόν που ονομάζεται ανθρακικό αμμώνιο.

Stuart ουρία ουρίας

Ο ζωμός ουρίας Stuart είναι περισσότερο ρυθμισμένος με ρΗ 6.8. Επομένως, ο μικροοργανισμός πρέπει να είναι σε θέση να σχηματίσει μεγάλες ποσότητες αμμωνίου για να γίνει κόκκινο σε φαινόλη. Το pH πρέπει να αυξηθεί πάνω από 8.

Ως εκ τούτου ζωμό ουρία είναι επιλεκτική για Stuart Proteus, δίδοντας θετικά αποτελέσματα σε 24 έως 48 ώρες επώασης, και δεν είναι αποτελεσματική για τα βακτηρίδια που παράγουν μικρές ποσότητες της ουρεάσης ή υδρολύονται αργά ουρία.

Αυτό οφείλεται σε είδη Proteus είναι ικανοί να χρησιμοποιούν ουρία σαν μια πηγή αζώτου. Αντίθετα, άλλα βακτήρια που παράγουν ουρεάση χρειάζονται μια πρόσθετη πηγή.

Ωστόσο, Pérez et al. (2002) προσδιορίστηκε ότι ο ζωμός ουρία Stuart ήταν τόσο αποτελεσματική όσο άγαρ ουρίας Christensen να καθορίσει ουρεάσης σε στελέχη ζυμομυκήτων των γενών Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon και Saccharomyces.

Οι συγγραφείς της μελέτης ισχυρίζονται ότι έχουν επιτύχει 100% σύμπτωση με αμφότερα τα μέσα (Stuart and Christensen) με επώαση για 24 και 48 ώρες. κάνοντας την προϋπόθεση ότι πήραν ως θετικά τα στελέχη που κατάφεραν να μετατρέψουν τα μέσα σε ένα ισχυρό ροζ-φούξια χρώμα.

Αυτή η διευκρίνιση είναι απαραίτητη, δεδομένου ότι ο Lodder (1970) επιβεβαίωσε ότι σχεδόν όλες οι ζύμες καταφέρνουν να τοποθετήσουν το λοβό άγαρ ουρίνης Christensen σε ανοιχτό ροζ. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι μπορούν να υδρολύουν την ουρία σε ελάχιστες ποσότητες και στον σχηματισμό αμίνων με την οξειδωτική αποκαρβοξυλίωση των αμινοξέων στην επιφάνεια. Αυτό δεν πρέπει να ερμηνεύεται ως θετικό.

Ζωμός ή άγαρ ουρίας από τον Christensen

Ο ζωμός ureas Christensen ή το άγαρ είναι λιγότερο ρυθμισμένο, είναι σε θέση να ανιχνεύσει μικρές ποσότητες αμμωνίου. Επιπλέον, αυτό το μέσο εμπλουτίζεται με πεπτόνες και γλυκόζη. Αυτές οι ενώσεις προκαλούν την ανάπτυξη άλλων μικροοργανισμών που παράγουν ουρεάση που δεν αναπτύσσονται στον ζωμό Stuart.

Ομοίως, η δοκιμή ουρίνης Christensen προσφέρει ταχύτερα αποτελέσματα, ειδικά για τον Proteus, έχοντας τη δυνατότητα να αποδίδει έντονα θετικά σε λιγότερο από 30 λεπτά ως ελάχιστο χρόνο και μέχρι 6 ώρες ως μέγιστο χρόνο.

Το υπόλοιπο των μικροοργανισμών που παράγουν ουρεάση επίτευξη χρώμα γυρίστε το ήμισυ ελαφρώς μετά από 6 ώρες, και ισχυρά σε 24, 48, 72 ώρες ή περισσότερο, και ακόμη και μερικά στελέχη μπορεί να δώσει ασθενές αντιδράσεις μετά από 5 ή 6 ημέρες.

Ερμηνεία και των δύο μέσων (Stuart και Christensen)

Το μέσο είναι αρχικά κίτρινο-πορτοκαλί χρώμα και μια θετική αντίδραση θα μετατρέψει το χρώμα του μέσου σε ροζ-φούξια. Η ένταση του χρώματος είναι ευθέως ανάλογη με την ποσότητα αμμωνίου που παράγεται.

Μία αρνητική αντίδραση θα αφήσει το μέσο του αρχικού χρώματος εκτός από τις ζύμες, οι οποίες μπορούν να δώσουν ανοιχτό ροζ με άγαρ ουρίας Christensen.

Προετοιμασία

Stuart ουρία ουρίας

Ζυγίστε τα απαραίτητα γραμμάρια σύμφωνα με τις ενδείξεις του εμπορικού οίκου. Διαλύεται σε κατά προτίμηση αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό. Μην χρησιμοποιείτε θερμότητα για να διαλύσετε, επειδή η ουρία είναι ευαίσθητη στη θερμότητα.

Η μέθοδος διήθησης μεμβράνης χρησιμοποιείται για την αποστείρωση. Γι 'αυτό, χρησιμοποιείται ένα φίλτρο Millipore με πόρους διαμέτρου 0,45 μ. Μην χρησιμοποιείτε αυτόκλειστο. Μόλις το διάλυμα διηθηθεί, κατανέμεται σε αποστειρωμένους σωλήνες. Για να ληφθούν αξιόπιστα αποτελέσματα, πρέπει να μεταφερθεί μεταξύ 1,5 ml ως ελάχιστη ποσότητα στα 3 ml ως μέγιστη ποσότητα ανά σωλήνα..

Να φυλάσσεται σε ψυγείο και να διατηρείται ηρεμία πριν από τη χρήση.

Εάν δεν έχετε τη μέθοδο της διήθησης, τα μέσα πρέπει να χρησιμοποιηθούν αμέσως για την απόκτηση αξιόπιστων αποτελεσμάτων.

Ένας άλλος τρόπος παρασκευής του ζωμού ουρίας Stuart έχει ως εξής:

Ορισμένα εμπορικά σπίτια πωλούν τη μισή βάση για τη δοκιμή ουρίας, χωρίς την ουρία.

Το ποσό που υποδεικνύεται από το εμπορικό κατάστημα ζυγίζεται. Διαλύεται σε αποσταγμένο νερό και αποστειρώνεται στο αυτόκλειστο στους 121 ° C για 15 λεπτά. Αφήνεται να ηρεμήσει λίγο και όταν το θρεπτικό μέσο είναι θερμό, προσθέστε 100 ml ενός διαλύματος ουρίας που παρασκευάζεται σε 20% και αποστειρώνεται με διήθηση.

Διανέμεται σε αποστειρωμένους σωλήνες, όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

Ζωμός ή άγαρ ουρίας από τον Christensen

-Παρασκευή του διαλύματος ουρίας

Ζυγίζονται 29 γραμμάρια αφυδατωμένης ουρίας και διαλύονται σε 100 ml απεσταγμένου νερού. Χρησιμοποιήστε τη μέθοδο φιλτραρίσματος για να αποστειρώσετε. Μην χρησιμοποιείτε αυτόκαυστο.

-Βάση άγαρ ουρίας

Διαλύονται 24 g άγαρ αφυδατωμένης βάσης σε 950 ml απεσταγμένου νερού. Αποστειρώστε στο αυτόκλειστο στους 121 ° C για 15 λεπτά. Αφήστε να σταματήσει μέχρι να φτάσει σε θερμοκρασία 50 ° C και προσθέστε την προπαρασκευασμένη ουρία ασηπτικά.

Χύστε 4 με 5 ml σε αποστειρωμένους σωλήνες και γυρίστε μέχρι να στερεοποιηθεί. Πρέπει να υπάρχει μια μακρά κορυφή φλογών.

Αυτό το μέσο μπορεί επίσης να παρασκευάζεται σε υγρή μορφή.

Χρησιμοποιεί

Η δοκιμή ουρίας είναι εξαιρετικά αποτελεσματική για τη διάκριση του γένους Proteus από άλλα γένη της Οικογένειας Enterobacteriaceae, δεδομένης της ταχείας αντίδρασης που παρέχεται από τον Proteus.

Εάν χρησιμοποιείται η σύνθεση Christensen, η δοκιμή βοηθά διαφοροποίηση μεταξύ των ειδών του ίδιου γένους. Για παράδειγμα, S. haemolyticus και S. warneri son Staphylococcus αρνητική και αιμοαιμολυτική, αλλά διαφέρουν σε αυτό S. haemolyticus είναι αρνητική ουρία και S. warneri είναι θετική ουρία.

Από την άλλη πλευρά, η McNulty χρησιμοποίησε με επιτυχία 2% ζωμό ureia Christensen για να μελετήσει την παρουσία του Helicobacter pylori σε δείγματα βιοψιών που ελήφθησαν από τον γαστρικό βλεννογόνο (περιοχή ανθραλλιών).

Η παρουσία του Η. Pylori αποδεικνύεται με θετικό τεστ ουρίας. Η διάρκεια παρατηρήσεως των αποτελεσμάτων είναι ευθέως ανάλογη προς την ποσότητα των παρόντων μικροοργανισμών.

Όπως μπορεί να φανεί, είναι μια απλή μέθοδος για τη διάγνωση του Helicobacter pylori σε γαστρικές βιοψίες.

Τέλος, η δοκιμή αυτή είναι επίσης χρήσιμη για τη διαφοροποίηση ειδών των γενών Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus και Mycobacteria.

Σπορά της δοκιμής ουρίας

Οι δύο μέθοδοι απαιτούν ένα ισχυρό μικροβιακό εμβόλιο για τη βελτιστοποίηση των αποτελεσμάτων. Οι βακτηριακές αποικίες κατά προτίμηση λαμβάνονται από αγάρ αίματος και μαγιά Sabouraud άγαρ, με μερικές εξαιρέσεις. Το εμβόλιο γαλακτωματοποιείται στο υγρό μέσο.

Για ζωμό ουρία Stuart επωάζονται στους 37 ° C για 24 έως 48 ώρες, γνωρίζοντας μόνο επιδιώκει στελέχη Proteus, όταν το στέλεχος είναι ένα βακτήριο. Για τους ζυμομύκητες μπορεί να επωαστεί στους 37 ° C ή σε θερμοκρασία δωματίου για 24 έως 48 ώρες επώασης.

Στην περίπτωση του ζωμού ουρίας Christensen επωάζονται στους 37 ° C για 24 ώρες. Εάν η δοκιμή είναι αρνητική, μπορεί να επωαστεί για έως και 6 ημέρες. Εάν η δοκιμή είναι θετική πριν 6 η ώρα, αυτό δείχνει ότι είναι ένα στέλεχος του γένους Proteus.

Στην περίπτωση άγαρ ουρίας Christensen, η ράβδος άγαρ ενοφθαλμίζεται έντονα, χωρίς διάτρηση. Ο ζωμός επωάζεται και ερμηνεύεται με τον ίδιο τρόπο.

Έλεγχος ποιότητας

Τα στελέχη ελέγχου μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη δοκιμή του μέσου, όπως π.χ. Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae  ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 και Salmonella typhimurium.  Τα πρώτα δύο πρέπει να δώσουν θετικά αποτελέσματα και τα δύο τελευταία αρνητικά αποτελέσματα.

Αναφορές

1. Pérez C, Goitía Κ., Mata S, Hartung Ο, Colella Μ, Reyes Η. et αϊ. Χρήση ζωμού ουρίας Stuart για τη δοκιμή ουρεάσης, ως δοκιμή στη διάγνωση των ζυμών. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. Διατίθεται στο: Scielo.org.
2. Mac Faddin Ι. (2003). Βιοχημικές δοκιμές για την ταυτοποίηση βακτηρίων κλινικής σημασίας. 3η έκδοση. Συντάκτης Panamericana. Μπουένος Άιρες Αργεντινή.
3. Forbes Β, Sahm D, Weissfeld Α. (2009). Μικροβιολογική διάγνωση της Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Αργεντινή.
4. Koneman Ε, Allen S, Janda W, Schreckenberger Ρ, Winn W. (2004). Μικροβιολογική διάγνωση. 5η έκδοση. Editorial Panamericana S.A. Αργεντινή.
5. Εργαστήρια Βρετανίας. Christensen Medio (Βάση άγαρ ουρίας) 2015. Διατίθεται στο: britanialab.com