Ίδρυμα, προετοιμασία και χρήσεις ΤΠΔ για τα άγαρ

Το ΤΑΙ άγαρ ή άγαρ σιδήρου τριπλού σακχάρου είναι ένα στερεό μέσο καλλιέργειας που χρησιμεύει ως βιοχημική δοκιμασία για την καθοδήγηση της αρχικής ταυτοποίησης των Gram αρνητικών βακιλίων. Βασίζεται στην απόδειξη της ζύμωσης των παρόντων σακχάρων και της παραγωγής υδρόθειου και αερίου.

Η σύνθεσή του και η ίδρυσή του είναι πολύ παρόμοια με τη δοκιμασία σιδήρου Kligler, με τη διαφορά ότι το τελευταίο περιέχει μόνο γλυκόζη και λακτόζη. Αντ 'αυτού, όπως υποδηλώνει το όνομα, ο τριπλός σίδηρος περιέχει τρείς ζυμώσιμους υδατάνθρακες: γλυκόζη, λακτόζη και σακχαρόζη..

Επιπλέον, το μέσο ΤΠΔ έχει τέσσερα παράγωγα πρωτεΐνης που το καθιστούν ένα πολύ θρεπτικό άγαρ: εκχύλισμα ζύμης, εκχύλισμα κρέατος, πεπτόνη και πεπτόνη πρωτεόνης. Περιέχει επίσης θειικό αμμώνιο σιδήρου, θειοθειικό νάτριο, χλωριούχο νάτριο, ερυθρό φαινόλης και άγαρ.

Η αδυναμία ενός μικροοργανισμού να ζυμώνει τη γλυκόζη που υπάρχει στο μέσο αποκλείει αμέσως την ανάρτηση από την οικογένεια Enterobacteriaceae. Ως εκ τούτου, η δοκιμή αυτή είναι απαραίτητη για να αποφασιστεί ποια πορεία αναγνώρισης πρέπει να ληφθεί για τον προσδιορισμό του γένους και του είδους.

Κάθε εργαστήριο αποφασίζει εάν συνεργάζεται με άγαρ TSI ή άγαρ Agar Kligler.

Ευρετήριο

• 1 Ίδρυμα
  • 1.1 Χλωριούχο νάτριο και άγαρ
  • 1.2 δείκτης pH (κόκκινο φαινόλης)
  • 1.3 Παραγώγων πρωτεϊνών (εκχύλισμα ζυμομυκήτων, εκχύλισμα κρέατος, πεπτόνη και πρωτεόνη πεπτόνη)
  • 1.4 Ζύμωση των υδατανθράκων (γλυκόζη, λακτόζη και σακχαρόζη)
  • 1.5 Παραγωγή αερίου
  • 1.6. Θειοθειικό νάτριο και θειικό αμμώνιο σίδηρο (παραγωγή υδρόθειου)
• 2 Προετοιμασία
• 3 Χρήσεις
• 4 Τοποθέτηση
• 5 Περιορισμοί
• 6 Αναφορές

Ίδρυμα

Κάθε μια από τις ενώσεις εκπληρώνει μια λειτουργία εντός του μέσου.

Χλωριούχο νάτριο και άγαρ

Το χλωριούχο νάτριο είναι απαραίτητο για τη διατήρηση της οσμωτικής ισορροπίας του μέσου. Ενώ το άγαρ δίνει τη σταθερή συνέπεια.

Ένδειξη PH (κόκκινο φαινόλης)

Το ρΗ του παρασκευασθέντος μέσου ισορροπείται στο 7,3 και ο δείκτης ρΗ (κόκκινο φαινόλης) γίνεται κίτρινο κάτω από 6,8. Αυτό σημαίνει ότι μικρές ποσότητες οξέος που παράγονται από τη ζύμωση σακχάρων θα μετατρέψουν το μέσο από κόκκινο πορτοκαλί σε κίτρινο.

Εάν η ζύμωση δεν συμβεί, θα γίνει αλκαλοποίηση του μέσου με τη χρήση των πεπτονών, μετατρέποντας από κόκκινο πορτοκαλί σε έντονο κόκκινο.

Παράγωγα πρωτεΐνης (εκχύλισμα ζύμης, εκχύλισμα κρέατος, πεπτόνη και πρωτεόνη πεπτόνη)

Όταν τα βακτήρια μεταβολίζουν τις πρωτεΐνες που υπάρχουν στο ΤΑΙ άγαρ, παράγονται αμίνες που αλκαλοποιούν το μέσο (κυρίως στο επίπεδο της κωνικότητας), επειδή η αντίδραση χρειάζεται οξυγόνο. Οι αμίνες μετατρέπουν τη στεφάνη σε έντονο κόκκινο χρώμα.

Αλλά αυτό θα εξαρτηθεί από την ικανότητα των βακτηρίων να ζυμώνουν τους υδατάνθρακες ή όχι.

Ζύμωση υδατανθράκων (γλυκόζη, λακτόζη και σακχαρόζη)

Η μελέτη της ζύμωσης των σακχάρων μπορεί να δώσει αρκετές εικόνες και κάθε μία ερμηνεύεται διαφορετικά. Η ερμηνεία της δοκιμής διαιρεί τους μικροοργανισμούς σε 3 κατηγορίες: ζυμωτές μη γλυκόζης, ζυμωτές μη λακτόζης και ζυμωτές λακτόζης / σακχαρόζης.

Πρέπει να σημειωθεί ότι η ποσότητα γλυκόζης στο μέσο είναι περιορισμένη, ενώ η συγκέντρωση της λακτόζης και της σακχαρόζης είναι 10 φορές υψηλότερη.

Τα βακτηρίδια της οικογένειας Enterobacteriaceae και άλλων μικροοργανισμών που ζυμώνονται με τη γλυκόζη θα αρχίσουν να ζυμώνουν αυτό το σάκχαρο επειδή είναι ο απλούστερος υδατάνθρακας για την ενέργεια..

Από την άλλη πλευρά, η λακτόζη και η σακχαρόζη είναι σύνθετοι υδατάνθρακες που πρέπει να διασπαστούν και να μετατραπούν σε γλυκόζη έτσι ώστε να μπορέσουν να εισέλθουν στον κύκλο Embden-Meyerhof.

-Μη ζυμωτικοί μικροοργανισμοί γλυκόζης

Όταν ο εμβολιασμένος μικροοργανισμός δεν είναι σε θέση να ζυμώσει τη γλυκόζη, πολύ λιγότερο μπορεί να ζυμώσει άλλους υδατάνθρακες. Επομένως, εδώ δεν σχηματίζονται οξέα, αλλά σχηματίζεται αμίνη στην κλίση λόγω της χρήσης πεπτονών.

Σε αυτή την περίπτωση η λοξότμητη στροφή γίνεται πιο έντονα κόκκινη και ο πυθμένας του σωλήνα μπορεί να παραμείνει αμετάβλητος ή μπορεί επίσης να αλκαλοποιηθεί, αφήνοντας ολόκληρο τον κόκκινο σωλήνα.

Ερμηνεία: K / K σημαίνει αλκαλικό λοξό / αλκαλικό ή ουδέτερο υπόβαθρο

Στην εικόνα που βρίσκεται στην αρχή του άρθρου, δείτε την εικόνα του σωλήνα D.

Αυτό το αποτέλεσμα υποδεικνύει ότι ο μικροοργανισμός δεν ανήκει στην οικογένεια Enterobacteriaceae.

-Μη-ζυμωτικοί μικροοργανισμοί λακτόζης / σακχαρόζης

Εάν τα βακτήρια είναι ικανά να ζυμώσουν τη γλυκόζη αλλά όχι τη λακτόζη ή τη σακχαρόζη, θα συμβούν τα εξής:

Το βακτήριο θα καταναλώνει όλη την υπάρχουσα γλυκόζη μετά από περίπου 6 έως 8 ώρες, έχοντας τη δυνατότητα να οξύνει τόσο τη λοξότμητη όσο και την taco. δηλαδή, το άγαρ θα έχει γίνει τελείως κίτρινο. Αλλά όταν η γλυκόζη εξαντληθεί και η αδυναμία χρήσης λακτόζης και σακχαρόζης, τα βακτήρια θα αρχίσουν το μεταβολισμό των πρωτεϊνών.

Αυτή η αντίδραση χρειάζεται οξυγόνο, επομένως η αποικοδόμηση των πεπτονών εμφανίζεται στην επιφάνεια (λοξοτομή). Οι αμίνες παρήγαγαν αλκαλικά τη στεφάνη μετατρέποντας το κίτρινο σε κόκκινο. Η αντίδραση αυτή αποδεικνύεται σε επώαση 18 έως 24 ωρών.

Ερμηνεία: Το K / A σημαίνει αλκαλική κλίση και όξινη taco.

Στην εικόνα που βρίσκεται στην αρχή του άρθρου, δείτε την εικόνα του σωλήνα Β.

-Ζυμωτικοί μικροοργανισμοί γαλακτόζης / σακχαρόζης

Προφανώς, οι μικροοργανισμοί που είναι ικανοί να ζυμώσουν τη λακτόζη και τη σακχαρόζη μπορούν να ζυμώσουν τη γλυκόζη. Μετά το ελάχιστο ποσό της γλυκόζης που υπάρχει στο μέσο εξαντληθεί, το πυροσταφυλικό που σχηματίζεται αρχίζει να μεταβολίζει προς σχηματισμό οξέων μέσω αερόβιας κύκλο του Krebs, και η περίοδος 8 έως 12 ώρες όλες τις μεσαίες είναι κίτρινο.

Εάν τα βακτήρια είναι ικανά να διαχωρίσουν τη λακτόζη ή τη σακχαρόζη, θα συνεχίσουν να παράγονται οξέα και μετά από 18 έως 24 ώρες ολόκληρο το ράμφος - ράμφος και taco - θα παραμείνει κίτρινο.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η χρήση της γλυκόζης γίνεται με δύο τρόπους: ένας σε αερόβια μορφή στη λοξοτομή του σωλήνα και ο άλλος αναερόβιος στον πυθμένα του σωλήνα.

Ερμηνεία: Το Α / Α σημαίνει όξινο λοξό / όξινο πυθμένα. Μπορεί να παρουσιάσει φυσικό αέριο ή όχι.

Στην εικόνα που βρίσκεται στην αρχή του άρθρου, δείτε την εικόνα του σωλήνα Α.

Παραγωγή αερίου

Ορισμένοι μικροοργανισμοί είναι ικανοί να παράγουν αέριο κατά τη διάρκεια της ζύμωσης των σακχάρων. Το αέριο αποδεικνύεται στον σωλήνα από την πίεση που ασκεί μέσα στο άγαρ. Η πίεση προκαλεί το σχηματισμό φυσαλίδων ή την μετατόπιση του άγαρ. Μερικές φορές ο σχηματισμός αερίου μπορεί να σπάσει το μέσο.

Είναι σημαντικό ότι κατά τη στιγμή της σποράς του μέσου TSI, η διάτρηση γίνεται καθαρά από το κέντρο του άγαρ μέχρι να φτάσει στον πυθμένα. Εάν η διάτρηση εκτραπεί προς τα τοιχώματα του σωλήνα, μπορεί να προκαλέσει ψευδώς θετικά αποτελέσματα στην παραγωγή του αερίου, καθώς θα διαφύγει μέσω του κακώς σχηματισμένου καναλιού.

Η παραγωγή φυσικού αερίου και οι αντιδράσεις που συμβαίνουν στο άγαρ bezel, χρειάζονται οξυγόνο, ως εκ τούτου, συνιστάται ότι ο σωλήνας είναι συνδεδεμένο με βύσμα βάμβακος, και εάν χρησιμοποιείται καπάκι βακελίτη, αυτό δεν θα πρέπει να οριστεί τελείως.

Η παραγωγή αερίου αναφέρεται ως θετική (+) ή αρνητική (-).

Θειοθειικό νάτριο και θειικό αμμώνιο σιδήρου (παραγωγή υδρόθειου)

Τα βακτήρια ικανά να παράγουν υδρόθειο (άχρωμο αέριο), λαμβάνουν το θείο του θειοθειικού νατρίου που υπάρχει στο μέσο. Μόλις σχηματιστεί το Η₂S αντιδρά με θειικό αμμώνιο σιδήρου, παράγοντας θειούχο σίδηρο (το μαύρο ίζημα είναι σαφώς ορατό).

Η παραγωγή του Η₂Το S αναφέρεται ως θετικό (+) ή αρνητικό (-).

Στην εικόνα που βρίσκεται στην αρχή του άρθρου, δείτε την εικόνα του σωλήνα C.

Προετοιμασία

Ζυγίζονται 62,5 γρ άγαρ αφυδατωμένης ζάχαρης τριπλής ζάχαρης (TSI) και διαλύονται σε ένα λίτρο απεσταγμένου νερού.

Θερμάνετε μέχρι να διαλυθεί πλήρως το άγαρ. Βράζουμε για ένα λεπτό ανάδευσης συχνά. Διανείμετε 4 ml του μέσου σε δοκιμαστικούς σωλήνες 13/100 με βαμβάκι.

Αποστειρώστε σε αυτόκλειστο στους 121 ° C για 15 λεπτά. Αφαιρέστε από το αυτόκλειστο και αφήστε να ξεκουραστεί με κλίση. Πρέπει να ληφθεί μέριμνα ώστε τόσο η βάση όσο και η στεφάνη να έχουν την ίδια απόσταση.

Φυλάσσετε σε ψυγείο 2-8 ° C. Αφήστε να κρυώσει πριν φτιάξετε το βακτηριακό στέλεχος.

Το χρώμα του αφυδατωμένου μέσου είναι ανοικτό μπεζ και το παρασκευασμένο μέσο είναι κόκκινο-πορτοκαλί

Το τελικό ρΗ του παρασκευασθέντος μέσου είναι 7,3 ± 0,2.

Χρησιμοποιεί

Η δοκιμή ΤΠΔ χρησιμοποιείται ευρέως στο επίπεδο του εργαστηρίου μικροβιολογίας. Η δοκιμή αυτή είναι ουσιώδης για την καθοδήγηση του είδους της δοκιμής που πρέπει να εφαρμοστεί για την εξακρίβωση του γένους και του είδους. Η καλή εκτέλεση και ερμηνεία του μπορεί να εξοικονομήσει υλικό και εργασία.

Εάν το αποτέλεσμα είναι ένα TSI Κ / Κ και εξέταση οξειδάσης κυτοχρώματος είναι θετική, είναι γνωστό ότι πρέπει να χρησιμοποιούνται δοκιμασίες για την ταυτοποίηση μη ζυμωτήρες όπως Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Burkholderia Gram αρνητικών βακίλλων, μεταξύ άλλων ύφη. Αν αρνητική οξειδάση είναι προσανατολισμένη προς το φύλο Acinetobacter, Stenotrophomonas, κ.λπ..

Αλλά αν μπορείτε να πάρετε μια ΤΠΔ Α / Α ή Κ / Α και δοκιμή οξειδάση κυτοχρώματος είναι αρνητική, περαιτέρω μείωση των νιτρικών σε νιτρώδη, έχουν βεβαιότητα ότι θα είναι ένας μικροοργανισμός που ανήκει στην οικογένεια Enterobacteriaceae. Στην περίπτωση αυτή η οδός αναγνώρισης θα προσανατολιστεί σε συγκεκριμένες δοκιμές για αυτή την ομάδα βακτηρίων.

Επιπλέον, αν ένα Κ / Α ή Α / Α εικόνας και δοκιμής κυτοχρώματος οξειδάσης είναι θετική αποκτάται, πρόσθετες δοκιμές για να οδηγούν θα στοχεύει στον προσδιορισμό ζύμωσης στελέχη που δεν ανήκουν στην οικογένεια Enterobacteriaceae, όπως Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio και Pasteurella.

Μια ΤΠΔ με υδρόθειο, αρνητική οξειδάση, θα καθοδηγήσει την ταυτοποίηση των ακόλουθων γενών της οικογένειας Enterobacteriaceae: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella ή Salmonella.

Μια ΤΠΔ με σπάνιο ή μέτριο υδρόθειο στην αλκαλική κλίση με αλκαλικό πυθμένα και θετική οξειδάση θα καθοδηγήσει τη χρήση δοκιμών για την αναγνώριση βακίλων αρνητικών κατά Gram, μη ζυμωτικών που παράγουν Η₂S, όπως Shewanella putrefaciens.

Τέλος, η ΤΠΔ μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση της παραγωγής υδρόθειου σε Gram θετικά βακίλλους, ιδίως όταν υπάρχει υποψία Erysipelothrix rhusiopathiae.

Σπαρμένο

Το μέσο TSI πρέπει να εμβολιαστεί με καθαρές αποικίες, απομονωμένες σε πρωτογενείς ή εκλεκτικές καλλιέργειες. Εάν η αποικία λαμβάνεται από εκλεκτικά μέσα που έχουν σπαρθεί με δείγματα με μικτή χλωρίδα, πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα για να ληφθεί μόνο η επιφάνεια, αφού στο κατώτερο τμήμα της αποικίας μπορεί να υπάρχουν βιώσιμα στελέχη που αναστέλλονται σε αυτό το μέσο.

Επομένως, ο βρόχος δεν θα πρέπει ποτέ να ψύχεται σε ένα εκλεκτικό μέσο για να πάρει στη συνέχεια την αποικία και να εμβολιάσει ένα μέσο ΤΣΙ.

Η φύτευση θα γίνει με ένα ευθύγραμμο βρόχο ή βελόνα. Θα γίνει μια παρακέντηση, φροντίζοντας να είναι μέσα από το κέντρο της μέσης μέχρι να φτάσει στον πυθμένα, και στη συνέχεια η φύτευση ολοκληρώθηκε να ενοφθαλμίζει την επιφάνεια με ζιγκ-ζαγκ. Μην κάνετε δύο διάτρηση.

Επωάστε στους 37 ° C σε αερόβιοση για 18-24 ώρες. Ερμηνεύστε αυτή τη στιγμή, ούτε πριν ούτε μετά.

Περιορισμοί

Η δοκιμή της ΤΠΔ πρέπει να διαβάζεται μεταξύ 18 και 24 ωρών επώασης. Μια ανάγνωση πριν από αυτό το χρονικό διάστημα μπορεί να δώσει ψευδώς θετική ζύμωση Α / Α. Ενώ μια ανάγνωση μετά από αυτό το χρονικό διάστημα μπορεί να προκαλέσει μια ψευδή αρνητική εικόνα μη ζυμωτήρα, λόγω της κατανάλωσης πεπτονών που αλκαλοποιούν το μέσο.

Αναφορές

1. Mac Faddin Ι. (2003). Βιοχημικές δοκιμές για την ταυτοποίηση βακτηρίων κλινικής σημασίας. 3η έκδοση. Συντάκτης Panamericana. Μπουένος Άιρες Αργεντινή.
2. Forbes Β, Sahm D, Weissfeld Α. (2009). Μικροβιολογική διάγνωση της Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Αργεντινή.
3. Koneman Ε, Allen S, Janda W, Schreckenberger Ρ, Winn W. (2004). Μικροβιολογική διάγνωση. 5η έκδοση. Editorial Panamericana S.A. Αργεντινή.
4. "Άγαρ ΤΠΔ". Wikipedia, Η ελεύθερη εγκυκλοπαίδεια. 10 Ιουλίου 2018, 08:09 UTC. 10 Φεβρουαρίου 2019, 03:33 Διαθέσιμο στη διεύθυνση: en.wikipedia.org
5. Εργαστήρια Βρετανίας. Άγαρ ΤΠΔ (τριπλό άγαρ από σίδηρο ζάχαρης). 2015. Διατίθεται στη διεύθυνση: britanialab.com
6. BD Laboratories Τριπλό άγαρ από σίδηρο ζάχαρης (TSI Agar). 2003. Διαθέσιμο σε: bd.com