Άγαρ Müeller Hinton ίδρυμα, προετοιμασία και χρήσεις

Το Άγαρ Müell Hinton Πρόκειται για ένα στερεό, μη επιλεκτικό θρεπτικό μέσο, ​​το οποίο αποτελείται από έγχυση κρέατος, πεπτίνη οξέος καζεΐνης, άμυλο, άγαρ και απεσταγμένο νερό. Αυτό το μέσο επιτρέπει μια εξαιρετική ανάπτυξη μικροβίων των ταχύτερα αναπτυσσόμενων βακτηρίων.

Αρχικά δημιουργήθηκε από τους John Howard Müeller και Jane Hinton για την απομόνωση βακτηρίων που απαιτούν θρεπτικά συστατικά, όπως Neisseria gonorrhoeae και Neisseria meningitidis. Ωστόσο, λόγω των χαρακτηριστικών του αποδείχθηκε να είναι ιδανικό για τη μελέτη της ευαισθησίας στα αντιβιοτικά, την παροχή αξιόπιστων και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα.

Ως εκ τούτου, το άγαρ Mueller Hinton είναι το μέσο καλλιέργειας που έγιναν δεκτές από το Ινστιτούτο Clinical and Laboratory Standards (CLSI) και Ευρωπαϊκή Επιτροπή για τον Αντιμικροβιακό Έλεγχο Ευαισθησίας για την εκτέλεση της μικροβιακής δοκιμής ευαισθησίας δια της μεθόδου διαχύσεως δίσκου Kirby και Bauer.

Ευρετήριο

• 1 Ίδρυμα
• 2 Προετοιμασία
• 3 Χρήσεις
  • 3.1 Αντιμικροβιακή τεχνική
  • 3.2 Στρατηγική τοποθέτηση δίσκων στο άγαρ Müeller Hinton
• 4 Αιτίες εσφαλμένων αποτελεσμάτων
• 5 Περιορισμός
• 6 Έλεγχος ποιότητας
• 7 Αναφορές

Ίδρυμα

Επειδή είναι ένα μη επιλεκτικό θρεπτικό μέσο, ​​είναι εξαιρετικό για την ανάπτυξη των περισσότερων παθογόνων βακτηρίων.

Επιπλέον, απλή σύνθεση του το καθιστά ουσίες εξαπλωθεί εύκολα γι 'αυτό είναι ένα ουσιαστικό χαρακτηριστικό για εξέταση ευαισθησίας με τη μέθοδο διάχυσης δίσκου.

Ένα άλλο από τα χαρακτηριστικά του είναι ότι περιέχει μια μικρή ποσότητα αναστολέων, η οποία επιτρέπει να αξιολογούνται αποτελεσματικά τα σουλφοναμίδια, η τριμεθοπρίμη και οι τετρακυκλίνες..

Ωστόσο, πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι το μέσο πρέπει να πληροί ορισμένες προϋποθέσεις για να εξασφαλίσει την ορθή λειτουργία του, μεταξύ των οποίων:

Ρύθμιση PH, βάθος άγαρ και κατάλληλη συγκέντρωση θυμίνης, θυμιδίνης, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ και Zn⁺⁺.

Πρέπει επίσης να γνωρίζουμε ότι η μεθοδολογία είναι τυποποιημένη και συνεπώς πρέπει να τηρηθούν όλες οι παράμετροι, όπως:

συγκέντρωση ενοφθαλμίσματος, συγκέντρωση και διατήρηση του αντιβιοτικού δίσκων, τοποθετώντας τον κατάλληλο αριθμό των δίσκων σε άγαρ, η απόσταση μεταξύ ενός δίσκου και άλλων στρατηγική τοποθέτηση ορισμένων αντιβιοτικών, η ατμόσφαιρα, θερμοκρασία και ο χρόνος επώαση.

Προετοιμασία

Ζυγίζονται 37 γρ. Του αφυδατωμένου μέσου Mueller Hinton και διαλύονται σε 1 λίτρο απεσταγμένου νερού. Θερμάνετε το μέσο ενώ ανακατεύετε για να το διαλύσετε. Αφήνουμε να βράσει για 1 λεπτό.

Πάρτε το αυτόκλειστο για να αποστειρώσετε στους 121 ° C για 15 λεπτά. Κατά την απομάκρυνση από το αυτόκλειστο, η φιάλη πρέπει να τοποθετηθεί σε υδατόλουτρο στους 50 ° C για ψύξη. Ρίξτε 25 έως 30 ml σε αποστειρωμένα τρυβλία Petri με διάμετρο 10 cm.

Οι πλάκες πρέπει να έχουν μέσο πάχος 4 mm (ιδανικό), με επιτρεπόμενη απόσταση 3-5 mm.

Εάν είναι επιθυμητό να παρασκευασθεί άγαρ αίματος με τη χρήση βάσης άγαρ Müeller Hinton, χύνεται 5% στείρο και απινιδωμένο αίμα αρνιού προτού να εξυπηρετηθεί στις πλάκες..

Το τελικό ρΗ του μέσου θα πρέπει να είναι μεταξύ 7,2 και 7,4.

Επενδύστε και αποθηκεύστε σε ψυγείο, μέχρι τη χρήση. Αφήστε την πλάκα να πάρει θερμοκρασία δωματίου πριν τη χρήση.

Το χρώμα του παρασκευασμένου μέσου είναι ελαφρώς μπεζ.

Χρησιμοποιεί

Χρησιμοποιείται για τη διεξαγωγή της αντιβιογραφίας ή της δοκιμής ευαισθησίας στα αντιβιοτικά στα περισσότερα μη ταχέως αναπτυσσόμενα παθογόνα.

Εάν το άγαρ συμπληρωθεί με αίμα, χρησιμεύει για την εκτέλεση του αντιβιογράμματος απαιτητικών μικροοργανισμών όπως: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, μεταξύ άλλων. Έχει επίσης χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση Legionella pneumophila.

Τεχνική αντιβιογράμματος

Πριν από την εκτέλεση του αντιβιογράμματος, πρέπει να προετοιμαστεί ένα βακτηριακό διάλυμα ισοδύναμο με 1,5 x 10⁸ κυττάρων.

Για να γίνει αυτό, λαμβάνουν 3 έως 4 αποικίες από καθαρή καλλιέργεια και διασκορπίζονται σε ένα θρεπτικό οπό τρυπτικάσης σόγιας ή ζωμό Mueller Hinton, επωάστηκαν για 2 έως 6 ώρες και η συγκέντρωση ρυθμίστηκε με αποστειρωμένο φυσιολογικό ορό, σε σύγκριση με ένα πρότυπο McFarland της 0,5%.

Εάν απαιτούν μικροοργανισμούς, οι αποικίες μπορούν να ανασταλούν απ 'ευθείας μέχρι να φθάσουν τη συγκέντρωση του 0,5% του Mac Farland. Στη συνέχεια, η πλάκα του Müeller Hinton σπέρνεται με ένα στέλεχος εμποτισμένο με το παρασκευασμένο βακτηριακό διάλυμα.

Για να το κάνετε αυτό, βυθίστε το στυλεό στο διάλυμα και, στη συνέχεια, αφαιρέστε την περίσσεια υγρού πιέζοντας τα τοιχώματα του σωλήνα. Αμέσως μετά το μάκτρο περνά κατά μήκος της επιφάνειας, αφήνοντας ανέγγιχτο θέσεις, τότε περιστρέφει ελαφρά την πλάκα και να μεταφυτευτούν. Η λειτουργία επαναλαμβάνεται 2 φορές.

Αφήστε να σταματήσετε για 10 λεπτά και, στη συνέχεια, τοποθετήστε τους δίσκους αντιβιοτικών με αποστειρωμένες λαβίδες, αφήνοντας μεταξύ τους απόσταση 24 mm. Αφού τοποθετήσετε κάθε δίσκο πάνω στο άγαρ πιέστε ελαφρά το καθένα με τον σφιγκτήρα για να βεβαιωθείτε ότι είναι καλά κολλημένα.

Μετά τη διαδικασία, η πλάκα αναστρέφεται και επωάζεται στους 35-37 ° C σε αερόβιοση για 16 έως 18 ώρες. Εάν είναι ένας απαιτητικός μικροοργανισμός, μπορεί να απαιτεί μικροαεροφιλία και αν το αντιβιογράφημα περιέχει δίσκους οξακιλλίνης θα πρέπει να διαβάζεται σε 24 ώρες.

Ένας χάρακας χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της διαμέτρου κάθε φωτοστέφανο. Τα αποτελέσματα πρέπει να καταγράφονται σε mm. Στη συνέχεια, οι λαμβανόμενες τιμές συσχετίζονται με τους πίνακες των σημείων κοπής που δημοσιεύονται από το τρέχον εγχειρίδιο CLSI.

Αναφέρετε ως ευαίσθητη (S), ενδιάμεση (I) ή ανθεκτική (R), ανάλογα με την περίπτωση.

Τα αντιβιοτικά επιλέγονται σύμφωνα με τον απομονωμένο μικροοργανισμό και τον τύπο μόλυνσης που συμβαίνει.

Μερικές φορές η στρατηγική τοποθέτηση αντιβιοτικών πρέπει να θεωρείται ότι παρουσιάζει πρότυπα φαινοτυπικής αντίστασης.

Στρατηγική τοποθέτηση δίσκων στο άγαρ Müeller Hinton

Για Enterobacteriaceae θα πρέπει να το κλαβουλανικό δίσκου κατά κεφαλοσπορίνες 3ης και 4ης γενιάς. Μια διεύρυνση σχήματος αυγού υποδεικνύει ότι το στέλεχος είναι παραγωγός βήτα-λακταμασών εκτεταμένου φάσματος (ESBL). Αυτό σημαίνει ότι ο ασθενής δεν πρέπει να υποβληθεί σε θεραπεία με κεφαλοσπορίνη.

Στον Staphylococcus είναι σημαντικό να τοποθετηθεί ο δίσκος ερυθρομυκίνης ή αζιθρομυκίνης μπροστά από τον δίσκο κλινδαμυκίνης (D-test).

Ένα ανθεκτικό αλογόνο στην ερυθρομυκίνη και μια ισοπέδωση στο αλογόνο κλινδαμυκίνης υποδεικνύει ότι το στέλεχος έχει επαγώγιμη αντίσταση στην κλινδαμυκίνη, το στέλεχος (RIC). Αυτό σημαίνει ότι η θεραπεία με κλινδαμυκίνη δεν θα είναι αποτελεσματική.

Αναζήτηση για AMP C επαγώγιμη στελεχών σε Enterobacteriaceae και ορισμένων μη-ζύμωσης Gram αρνητικών βακίλλων, δίσκοι κεφταζιδίμη, κεφοξιτίνη ή πιπερακιλλίνη ταζοβακτάμης έναντι όψη του δίσκου ιμιπενέμη σε απόσταση 27 χιλιοστών.

Ένα φωτοστέφανο πεπλατυσμένο σε έναν από τους δίσκους που έρχονται αντιμέτωποι με ιμιπενέμη υποδεικνύει την παρουσία επαγόμενου ΑΜΡ C.

Για την έρευνα για το συστατικό AMP C, ένας δίσκος 500 μg cloxacillin έρχεται αντιμέτωπος με ceftazidime (30 μg) και με cefotaxime (30 μg), σε απόσταση 25 mm. Ένα διευρυμένο φωτοστέφανο σε μία από τις κεφαλοσπορίνες υποδεικνύει θετικότητα.

Ο δίσκος της κλοξακιλλίνης μπορεί επίσης να αντικατασταθεί από ένα δίσκο 9 χιλ. Του χαρτιού διηθήσεως Whatman Νο. 6 εμποτισμένο με φαινυλο βορονικό οξύ (400 μγρ.) Με απόσταση 18 mm. Έχει την ίδια ερμηνεία με την προηγούμενη.

Τέλος, για να διερευνηθεί η παραγωγή μεταλλο-β-λακταμασών, ιδιαίτερα στο Pseudomonas aeruginosa, εμποτισμένες δίσκου που χρησιμοποιείται με 10 μΐ του αιθυλενοδιαμινοτετραοξικού οξέος (EDTA 750 g) και θειογλυκολικό οξύ (SMA 300 mg), η οποία αντιμετωπίζει τους δίσκους ιμιπενέμη και μεροπενέμη, σε απόσταση 15 mm.

Η δοκιμή είναι θετική εάν υπάρχει διαπλάτυνση της ιμιπενέμης ή meropenem φωτοστέφανα στη EDTA δίσκο / SMA. Αυτό το αποτέλεσμα πρέπει να επιβεβαιωθεί από την τροποποιημένη δοκιμασία Hodge.

Αυτή η μέθοδος συνίσταται στον εμβολιασμό ενός στελέχους του Escherichia coli ATCC 25922 επί της πλάκας Müeller Hinton. δίσκος ιμιπενέμη τοποθετείται στο κέντρο της πλάκας και στη συνέχεια μια αύλακα είναι κατασκευασμένο από το δίσκο προς την περιφέρεια με το στέλεχος Ρ. Aeruginosa ύποπτος Μπορείτε να δοκιμάσετε μέχρι 4 στελέχη ανά πλάκα.

Η δοκιμή θα είναι θετική αν υπάρχει ζώνη παραμόρφωσης του ιμιπενεμού γύρω από το στρώμα.

Αιτίες λανθασμένων αποτελεσμάτων

-Οι δίσκοι με ελάχιστα συντηρημένα αντιβιοτικά μπορεί να παράγουν ψευδείς αντιστάσεις. Για παράδειγμα, ο δίσκος οξακιλλίνης είναι πολύ ευάλωτος στις μεταβολές της θερμοκρασίας.

-Ένα ρΗ του μέσου κάτω από την ενδεικνυόμενη (οξύ) παράγει μικρότερες φωτοστέφανα σε αμινογλυκοσίδες και μακρολίδες (κίνδυνος ψευδών αντίστασης), και τα μεγαλύτερα φωτοστέφανα πενικιλίνη, τετρακυκλίνη και νοβοβιοκίνη (κίνδυνος ψευδών ευαισθησία).

-Εάν το ρΗ είναι πάνω από το υποδεικνυόμενο (αλκαλικό), τα αποτελέσματα που περιγράφηκαν παραπάνω αντιστρέφονται.

-Τα μέσα με υψηλές συγκεντρώσεις θυμίνης και θυμιδίνης επηρεάζουν σημαντικά τη μείωση των φραγμών αναστολής των σουλφοναμιδίων και της τριμεθοπρίμης.

-Οι υψηλές συγκεντρώσεις ασβεστίου και μαγνησίου παράγουν ψευδή αντίσταση αμινογλυκοσιδών, πολυμυξίνης Β και τετρακυκλινών έναντι στελεχών Pseudomonas aeruginosa.

-Οι χαμηλές συγκεντρώσεις ασβεστίου και μαγνησίου παράγουν ψευδείς ευαισθησίες αμινογλυκοζιτών, πολυμυξίνης Β και τετρακυκλινών έναντι στελεχών Pseudomonas aeruginosa.

-Η παρουσία ψευδαργύρου επηρεάζει τα αποτελέσματα των δίσκων carbapenems (imipenem, meropenem και ertapenem).

-Το πάχος του μέσου κάτω από 3 mm παράγει ψευδή αποτελέσματα ευαισθησίας, ενώ ένα πάχος πάνω από 5 θα παράγει ψευδή αντίσταση.

-Η κινητοποίηση των δίσκων στο αντιβιογράφημα θα δώσει παραμορφωμένους αλογόνους, αφού η εκκένωση του αντιβιοτικού είναι άμεση.

- Τα πολύ ασθενή ενοφθαλμίσματα επηρεάζουν τα αποτελέσματα, δεδομένου ότι δεν θα υπάρξει ομοιόμορφη ή συρρέουσα ανάπτυξη στο άγαρ, απαραίτητη προϋπόθεση για να είναι δυνατή η μέτρηση των ζωνών αναστολής, επιπλέον του γεγονότος ότι τα αλογόνες μπορούν να δώσουν μεγαλύτερο από το κανονικό.

-Ο υπερβολικά φορτισμένος εμβολιασμός μπορεί να δώσει μικρότερες τιμές από τις κανονικές.

-Η μη τήρηση της απόστασης μεταξύ των δίσκων προκαλεί το ένα φωτοστέφανο να επικαλύπτει άλλο και δεν μπορεί να διαβαστεί σωστά.

-Επωάστε με CO₂ αυξάνει το μέγεθος των αλάτων των δισκίων τετρακυκλίνης και μεθικιλλίνης.

-Η επώαση σε θερμοκρασίες κάτω των 35 ° C παράγει μεγαλύτερα φωτοστέφανα.

-Η προσθήκη αίματος ελαττώνει το μέγεθος του αλογόνου των σουλφοναμιδίων.

Περιορισμός

Η ευαισθησία ενός αντιβιοτικού που παρουσιάστηκε στο αντιβιογράφημα έναντι ενός μικροοργανισμού (in vitro) δεν αποτελεί εγγύηση ότι θα λειτουργήσει in νίνο.

Έλεγχος ποιότητας

Για να μάθετε εάν το μέσο περιέχει τη σωστή ποσότητα θυμίνης, πρέπει να σπαρθεί ένα στέλεχος του Enterococcus faecalis ATCC 29212 και δοκιμάζοντας την ευαισθησία σε τριμεθοπρίμη σουλφαμεθοξαζόλη (SXT), θα πρέπει να δώσει ένα φωτοστέφανο ίσο ή> 20 mm να είναι ικανοποιητικό.

Αναφορές

1. "Άγαρ Müller-Hinton." Wikipedia, Η ελεύθερη εγκυκλοπαίδεια. 16 Νοεμβρίου 2018, 12:23 UTC. 27 Ιανουαρίου 2019, 04:22
2. Forbes Β, Sahm D, Weissfeld Α. (2009). Μικροβιολογική διάγνωση της Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Αργεντινή.
3. Cona Ε. Συνθήκες για μια καλή μελέτη ευαισθησίας με δοκιμή διάχυσης άγαρ. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Το εργαστήριο Difco Francisco Soria Melguizo. Άγαρ Müell Hinton με 5% αίμα προβάτου. 2009. Διατίθεται στη διεύθυνση: http://f-soria.es
5. Εργαστήριο BD Müeller Hinton II Agar. 2017. Διατίθεται στη διεύθυνση: .bd.com
6. Εργαστήρια Βρετανίας. Άγαρ Müell Hinton. 2015. Διατίθεται στη διεύθυνση: britanialab.com
7. Koneman Ε, Allen S, Janda W, Schreckenberger Ρ, Winn W. (2004). Μικροβιολογική διάγνωση. 5η έκδοση. Editorial Panamericana S.A. Αργεντινή.
8. Martínez-Rojas D. Betalactamasas τύπου AmpC: Γενικές και μέθοδοι για φαινοτυπική ανίχνευση. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Διατίθεται στο: scielo.org.
9. Perozo Α, Castellano Μ, Ling Ε, Arraiz Ν. Φαινοτυπική ανίχνευση μεταλλοβεταλακταμάσεων σε κλινικά απομονωμένα στελέχη Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Διατίθεται στο: scielo.org.