Agar M.R.S ίδρυμα, προετοιμασία και χρήσεις



Το agar M.R.S. είναι ένα εκλεκτικό στερεό μέσο καλλιέργειας που χρησιμοποιείται για την απομόνωση και καταμέτρηση βακτηρίων γαλακτικού οξέος, ειδικά του γένους Lactobacillus. Αυτό το άγαρ δημιουργήθηκε το 1960 από τους Man, Rogosa και Sharpe, το μέσο που φέρει το ίδιο όνομα, αλλά λόγω της πολυπλοκότητάς του η συντομογραφία M.R.S χρησιμοποιείται συχνά..

Αποτελείται από πρωτεόζης πεπτόνης, εκχύλισμα κρέατος, εκχύλισμα ζύμης, γλυκόζη, μονοελαϊκή σορβιτάνη, φωσφορικό δικάλιο, οξεικό νάτριο, κιτρικό αμμώνιο, θειικό μαγνήσιο, θειικό μαγγάνιο και άγαρ.

Αυτή η σύνθεση επιτρέπει τη σωστή ανάπτυξη βακτηρίων γαλακτικού οξέος από κλινικά δείγματα, όπως κόπρανα, κολπική έκκριση, στοματικά δείγματα και μητρικό γάλα, καθώς και γαλακτοκομικά και κρέατα..

Δεν χρησιμοποιείται συνήθως στα κλινικά εργαστήρια, επειδή τα βακτηρίδια γαλακτικού οξέος σπάνια εμπλέκονται σε παθολογικές διεργασίες. Εν τούτοις, η χρήση του M.R.S άγαρ είναι πιο συχνή στον τομέα της μικροβιολογίας τροφίμων..

Από την άλλη πλευρά, αυτό το μέσο χρησιμοποιείται από μερικά Ερευνητικά Κέντρα, στόχος των οποίων είναι η μελέτη βακτηρίων γαλακτικού οξέος.

Ευρετήριο

  • 1 Ίδρυμα
  • 2 Προετοιμασία
  • 3 Χρήσεις
    • 3.1 Χαρακτηριστικά των αποικιών
    • 3.2 Απομόνωση βακτηρίων γαλακτικού οξέος
    • 3.3 Καταμέτρηση βακτηρίων γαλακτικού οξέος
    • 3.4 Στο ερευνητικό επίπεδο
  • 4 Έλεγχος ποιότητας
  • 5 Αναφορές

Ίδρυμα

Ο άγαρ Άνθρωπος, Rogosa και Sharpe έχει μια πολύ περίπλοκη σύνθεση. Με τη διάλυση της λειτουργίας που εκπληρώνει κάθε στοιχείο, μπορεί να εξηγηθεί το θεμέλιο της.

Η πρωτεόνη πεπτόνη, εκχύλισμα κρέατος, εκχύλισμα ζύμης και γλυκόζη είναι θρεπτικά συστατικά που παρέχουν την πηγή άνθρακα, αζώτου, βιταμινών και ανόργανων συστατικών που είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη των βακτηρίων. Επιπλέον, η γλυκόζη είναι η καθολική πηγή ενέργειας που χρησιμοποιείται στα περισσότερα μέσα καλλιέργειας.

Επιπλέον, για την προώθηση της ανάπτυξης των βακτηρίων γαλακτικού οξέος, είναι απαραίτητο η παρουσία των συμπαραγόντων (κατιόντα) απαραίτητη στον μεταβολισμό των Lactobacillus και συναφών βακτήρια? Αυτές οι ενώσεις είναι τα άλατα νατρίου, μαγνησίου και μαγγανίου.

Παρομοίως, μονοελαϊκή σορβιτάνη ή πολυσορβικό 80 είναι μια πηγή σημαντικών λιπαρών οξέων όταν απορροφώνται ως θρεπτικά συστατικά.

Επιπλέον, η μονοελαϊκή σορβιτάνη και το κιτρικό αμμώνιο δρουν αναστέλλοντας την ανάπτυξη της συνοδευτικής χλωρίδας, ιδιαίτερα Gram-αρνητικών βακτηριδίων, παρέχοντας τον εκλεκτικό χαρακτήρα αυτού του άγαρ.

Τέλος, το άγαρ-άγαρ είναι αυτό που δίνει τη σταθερή σύσταση στο μέσο.

Υπάρχουν και άλλες παραλλαγές του άγαρ Man Rogosa Sharpe. το ένα είναι συμπληρωμένο με κυστεΐνη (M.R.S.c), χρήσιμες για την απομόνωση bifidobacteria, μεταξύ άλλων μικροοργανισμών. Επιπλέον, υπάρχει το μέσο MRS συμπληρωμένο με νεομυκίνη, η παρομομυκίνη, ναλιδιξικό οξύ και χλωριούχο λίθιο, ειδικά για την επιλεκτική καταμέτρηση των bifidobacteria στα γαλακτοκομικά προϊόντα.

Προετοιμασία

Ζυγίζονται 68,25 γραμμάρια του αφυδατωμένου μέσου και διαλύονται σε ένα λίτρο απεσταγμένου νερού. Αφήστε να σταματήσετε για 5 λεπτά. Για να διαλυθεί στο σύνολό του, φέρτε σε μια πηγή θερμότητας ανακατεύοντας συχνά και αφήνετε να βράσει για 1 έως 2 λεπτά. Αποστειρώστε σε αυτόκλειστο στους 121 ° C για 15 λεπτά.

Όταν φεύγετε από το αυτόκλειστο αφήστε να σταθεί σε λίγα λεπτά και διανείμετε ακόμη ζεστό σε αποστειρωμένα πιάτα Petri.

Αφήστε να στερεοποιηθούν και να αντιστραφούν οι πλάκες, να παραγγελθούν σε τακάκια και να αποθηκευτούν στο ψυγείο μέχρι τη χρήση. Αφήστε τις πλάκες να πάρουν θερμοκρασία δωματίου πριν τις χρησιμοποιήσετε.

Το ρΗ του μέσου θα πρέπει να είναι 6,4 ± 0,2. Ορισμένες εμπορικές κατοικίες συνιστούν pH μεταξύ 5,5 και 5,9.

Το αφυδατωμένο μέσο είναι μπεζ και παρασκευάζεται είναι σκούρο πορτοκαλί.

Τόσο το αφυδατωμένο μέσο όσο και οι προετοιμασμένες πλάκες πρέπει να φυλάσσονται στους 2 έως 8 ° C.

Χρησιμοποιεί

Οι πλάκες άγαρ M.R.S. μπορούν να σπαρθούν στην επιφάνεια (εξάντληση ή με σπάτουλα του Drigalski). Μπορεί επίσης να σπαρθεί από βάθος. Οι πλάκες πρέπει να επωάζονται στους 37 ° C σε μικροαερόφιλες (4% O2 και 5-10% CO2) για 24 έως 72 ώρες.

Η μέθοδος σποράς επιλέγεται σύμφωνα με τον επιδιωκόμενο σκοπό (απομόνωση ή μέτρηση).

Χαρακτηριστικά των αποικιών

Οι υποθετικές αποικίες του Lactobacillus αναπτύσσονται υπόλευκες και έχουν βλεννώδη ή κρεμώδη εμφάνιση σε αυτό το άγαρ. Τότε πρέπει να ταυτοποιήσουν.

Απομόνωση βακτηρίων γαλακτικού οξέος

Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιείται η φύτευση ανά επιφάνεια. Τα δείγματα που πρόκειται να φυτευτούν απαιτούν προηγούμενη διαδικασία. 

Στην περίπτωση των δειγμάτων μητρικού γάλακτος, συνιστάται η φυγοκέντρηση 1 ml του δείγματος σε 14,000 rmp για 10 λεπτά, προκειμένου να αφαιρεθεί το λιπαρό στρώμα. 900 μΐ απορρίπτονται και στα υπόλοιπα 100 μΐ το ίζημα εναιωρείται και χύνεται επί του M.R.S. Στη συνέχεια, πρέπει να κατανέμεται ομοιόμορφα με μια σπάτουλα του Drigalski.

Στην περίπτωση δειγμάτων κοπράνων, ένα (1) γραμμάριο κοπράνων ζυγίζεται και ομογενοποιείται σε 9 mL 0,1% στείρου πεπονιούχου νερού, που αντιστοιχεί σε αραίωση 1/10. Στη συνέχεια γίνονται σειριακές αραιώσεις, μέχρι να ληφθεί τελική αραίωση 10-4.

Τέλος, λαμβάνονται 100 μΐ των αραιώσεων 10-2, 10-3 και 10-4 και κάθε αραίωση σπείρεται σε MRS άγαρ, διανέμοντας ομοιόμορφα με σπάτουλα Drigalski.

Καταμέτρηση βακτηρίων γαλακτικού οξέος

Σε αυτή την περίπτωση η σπορά γίνεται από βάθος.

Για δείγματα μητρικού γάλακτος, πάρτε 1 mL και τοποθετήστε το σε αποστειρωμένο κωνικό πλαστικό σωλήνα. Το MRS άγαρ προστίθεται σε θερμοκρασία περίπου 40 ° C μέχρι τελικού όγκου 25 mL, λαμβάνοντας ένα ομοιογενές μίγμα. Στη συνέχεια, χύνεται σε αποστειρωμένα τρυβλία Petri με ομοιόμορφο τρόπο και αφήνεται να σταθεί μέχρι να πολυμεριστεί..

Διενεργούνται αραιώσεις για δείγματα κοπράνων, όπως περιγράφεται παραπάνω. Λαμβάνετε 1 mL από κάθε αραίωση και τοποθετείτε σε αποστειρωμένους κωνικούς πλαστικούς σωλήνες. Το τετηγμένο άγαρ MRS προστίθεται σε όγκο 25 mL.

Το μίγμα κάθε αραίωσης χύνεται ομοιόμορφα σε αποστειρωμένα τρυβλία Petri. Τελικά αφήστε το να σταθεί μέχρι τον πολυμερισμό του.

Στο ερευνητικό επίπεδο

Κάθε μέρα η μελέτη των βακτηρίων γαλακτικού οξέος γίνεται πιο ενδιαφέρουσα. ειδικά οι ερευνητές επιδιώκουν να γνωρίσουν τα νέα στελέχη και τις δυνατότητές τους ως εναρκτήρια ζύμωση για τυποποίηση στην παραγωγή γαλακτοκομικών προϊόντων, μεταξύ άλλων χρήσεων.

Με αυτή την έννοια, οι Alvarado et αϊ. (2007) χρησιμοποίησαν το M.R.S. άγαρ. να πραγματοποιήσουν μια μελέτη στην οποία απομόνωσαν, ταυτοποίησαν και χαρακτήρισαν βακτήρια γαλακτικού οξέος που υπήρχαν σε ένα βιοτεχνικό καπνιστό τυρί Βενεζουέλας.

Σε τυρί βρήκαν την παρουσία βακτηρίων του γένους Lactococcus και Lactobacillus, και κατέληξε στο συμπέρασμα ότι τα μίγματα απομονώσεις είναι κατάλληλα ως στελέχη starter στην παρασκευή των τυριών από παστεριωμένο γάλα.

Από την άλλη πλευρά, οι Sánchez et al. (2017) χρησιμοποίησε M.R.S άγαρ. για τη διερεύνηση της παρουσίας βακτηρίων γαλακτικού οξέος στην πεπτική οδό των χοιριδίων, προκειμένου να χρησιμοποιηθούν ως εγγενή προβιοτικά που αυξάνουν την παραγωγικότητα των υγιή χοιριδίων.

Με αυτό το μέσο κατάφεραν να απομονώσουν τέσσερα είδη: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae και Pediococcus pentosaceus.

Ομοίως, ο Báez et αϊ. (2019) χρησιμοποίησε M.R.S. άγαρ. για την αξιολόγηση βακτηρίων γαλακτικού οξέος (BAL) και διφωσφορικών βακτηριδίων με προβιοτικό δυναμικό στο μητρικό γάλα και στα κόπρανα των βρεφών.

Κατάφεραν να απομονώσουν 11 BAL και 3 Bifidobacteria sp στο μητρικό γάλα και 8 BAL και 2 Bifidobacteria sp. στο σκαμνί Όλα ικανοποίησαν ορισμένες παραμέτρους που τους αναγνωρίζουν ως βακτήρια με προβιοτική δραστηριότητα.

Οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι τόσο το μητρικό γάλα όσο και τα περιττώματα των βρεφών που θηλάζουν αποκλειστικά χρησιμεύουν ως φυσικές πηγές προβιοτικών βακτηρίων.

Έλεγχος ποιότητας

Για την αξιολόγηση της ποιότητας του M.R.S. μπορούν να χρησιμοποιηθούν στελέχη ελέγχου όπως:

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum ΜΚΤΑ 8014, Lactobacillus lactis ΜΚΤΑ 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli και Bacillus cereus.

Τα αναμενόμενα αποτελέσματα είναι ικανοποιητική ανάπτυξη για τα πρώτα 6 βακτήρια, ενώ Ε. Coli και Bacillus cereus πρέπει να αναστέλλεται στο σύνολό της.

Αναφορές

  1. Alvarado C, Chacon Z, Otoniel J, Guerrero Β, Lopez G. Απομόνωση, Ταυτοποίηση και Χαρακτηρισμός των βακτηρίων γαλακτικού οξέος ενός τυριού Βενεζουέλας Artisan Καπνιστό Andino. Η χρήση του ως καλλιέργεια εκκίνησης. Επιστήμονας (Maracaibo) 2007 · 17 (3): 301-308. Διατίθεται στο: scielo.org.
  2. Sánchez H, Fabián F, Ochoa G, Alfaro Απομόνωση βακτηρίων γαλακτικού οξέος από την πεπτική οδό του χοιριδίου. Επανεξέταση. vet. Περού 2017; 28 (3): 730-736. Διατίθεται στο: scielo.org.
  3. Baez Ε, González G, Hernandez G, Lopez Ε, Mega Μ Αξιολόγηση των βακτηρίων γαλακτικού οξέος και Bifidobacteria με προβιοτικά δυναμικό στο γάλα και βρέφος περιττώματα του μαστού στην πόλη Acevedo, Miranda 2017. Βαθμός εργασία για το βαθμό των αποφοίτων Βιοανάλυση Πανεπιστήμιο Carabobo, Βενεζουέλα.
  4. Βρετανικό Εργαστήριο M.R.S agar. 2015. Διατίθεται στη διεύθυνση: britanialab.com
  5. Συμμετέχοντες στη Wikipedia. MRS άγαρ Wikipedia, Η ελεύθερη εγκυκλοπαίδεια. 10 Ιανουαρίου 2018, 19:44 UTC. Διατίθεται στη διεύθυνση: wikipedia.org Πρόσβαση στις 17 Φεβρουαρίου 2019.
  6. Roy D. Media για την απομόνωση και απαρίθμηση των bifidobacteria στα γαλακτοκομικά προϊόντα. Int J Food Microbiol, 200128; 69 (3): 167-82.