Ιδρυμα LIA Agar LIA (Λυσίνη), προετοιμασία και χρήσεις

Το LIA άγαρ (Σίδηρος λυσίνης) είναι μια βιοχημική δοκιμασία που χρησιμοποιείται για την αναγνώριση των βακτηρίων της οικογένειας Enterobacteriaceae. Αυτό το μέσο δημιουργήθηκε από τους Edwards και Fife, με βάση τη φόρμουλα του Falkow.

Αρχικά η δοκιμή αυτή ήταν ένας ζωμός που περιείχε πεπτόνες, εκχύλισμα ζυμομύκητα, γλυκόζη, L-λυσίνη, μωβ βρωμοκρεσόλη και αποσταγμένο νερό. Οι Edwards και Fife προστέθηκαν άγαρ-άγαρ, κιτρικό τριανδριο-αμμώνιο και θειοθειικό νάτριο.

Η δοκιμή βασικά συνίσταται στην απόδειξη της παρουσίας του ενζύμου δεκαρβοξυλάση λυσίνης, ικανή να αντιδράσει με την καρβοξυλική ομάδα του αμινοξέος L-λυσίνη. Μια αποαμίνωση του αμινοξέος μπορεί επίσης να συμβεί λόγω της παρουσίας του ενζύμου δεαμινάση λυσίνης.

Επιπροσθέτως, η σύνθεση του μέσου επιτρέπει να αποδειχθεί η ικανότητα ορισμένων βακτηριακών γενών να παράγουν υδρόθειο. Τέλος, είναι επίσης δυνατό να παρατηρηθεί η παραγωγή ή όχι του αερίου στη μέση.

Ευρετήριο

• 1 Ίδρυμα
  • 1.1 Πεπτόνες και εκχύλισμα ζύμης
  • 1.2 Γλυκόζη
  • 1.3 L-λυσίνη
  • 1.4 Δείκτης pH (μωβ βρωμοκρεσόλη)
  • 1.5 Κιτρικό τριαμίδιο αμμωνίου και θειοθειικό νάτριο
• 2 Ερμηνεία της δοκιμής
  • 2.1 Αποκαρβοξυλίωση της λυσίνης
  • 2.2 Αφαίρεση της λυσίνης
  • 2.3 Παραγωγή υδρόθειου (H2S)
• 3 Καταγραφή αποτελεσμάτων
• 4 Προετοιμασία
• 5 Χρήσεις
• 6 Αναφορές

Ίδρυμα

Πεπτόνες και εκχύλισμα ζύμης

Όπως και τα περισσότερα μέσα καλλιέργειας, το άγαρ της λυσίνης σιδήρου περιέχει συστατικά που παρέχουν την πηγή των θρεπτικών συστατικών που είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη των βακτηρίων. Αυτά τα συστατικά αντιπροσωπεύονται από πεπτόνες και εκχύλισμα ζύμης.

Γλυκόζη

Επίσης, αυτό το άγαρ περιέχει ζυμώμενη γλυκόζη υδατάνθρακα. Είναι γνωστό ότι όλα τα βακτηρίδια της οικογένειας Enterobacteriaceae ζυμώνουν τη γλυκόζη.

Αυτό το βήμα είναι κρίσιμο, διότι θα είναι υπεύθυνο για την οξίνιση του μέσου, μια ουσιαστική προϋπόθεση για το ένζυμο λυσίνη δεκαρβοξυλάση, εάν υπάρχει, να δράσει στο υπόστρωμα.

Σε ορισμένα βακτηριακά γένη, μπορεί να παρατηρηθεί η παραγωγή αερίου λόγω της ζύμωσης της γλυκόζης.

Το αέριο αποδεικνύεται όταν υπάρχει μετατόπιση του άγαρ στον σωλήνα, αφήνοντας ένα κενό χώρο στον πυθμένα του σωλήνα ή με θραύση του μέσου σε δύο ή περισσότερα τμήματα.

L-λυσίνη

Μόλις η λυσίνη αποκαρβοξυλιωθεί, σχηματίζεται μια διαμίνη (cadaverine) και διοξείδιο του άνθρακα.

Η αποκαρβοξυλίωση λαμβάνει χώρα παρουσία φωσφορικού πυριδοξαλικού συνενζύμου. Αυτή η αντίδραση είναι μη αναστρέψιμη.

Ένδειξη PH (μωβ βρωμοκρεσόλη)

Όλες οι μεταβολές του ρΗ εμφανίστηκαν στο μέσο από τις διαφορετικές αντιδράσεις, ανιχνεύονται με τον δείκτη μωρών βρωμοκρεσόλης pH.

Με αυτή την έννοια, όταν υπάρχει οξίνιση, το μέσον γίνεται κίτρινο και όταν υπάρχει αλκαλοποίηση το μέσον επιστρέφει στο αρχικό μοβ ή μοβ χρώμα.

Όταν εμφανίζεται απολίνωση της λυσίνης λόγω της παρουσίας του ενζύμου δεαμινάση λυσίνης, σχηματίζεται στην επιφάνεια ένα κοκκινωπό χρώμα, τυπικό για τα γένη Proteus, Providencia και ορισμένα είδη Morganella..

Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι κατά τη διάρκεια της διαδικασίας αποαμινώσεως σχηματίζεται άλφα-κετο-καρβονικό οξύ, το οποίο αντιδρά με κιτρικό αμμώνιο παρουσία οξυγόνου, το οποίο προκαλεί το προαναφερθέν χρώμα.

Κάλιο σιδήρου αμμωνίου και θειοθειικό νάτριο

Από την άλλη πλευρά, τα βακτηρίδια που παράγουν υδρόθειο θα τεκμηριώνονται από την παρουσία θειοθειικού νατρίου (πηγή θείου) και κιτρικού αμμωνίου σιδήρου, που είναι ο κατασκευαστής του Η₂S.

Τα βακτήρια που διαθέτουν ένζυμο θειοθειικής ρεδουκτάσης έχουν την ικανότητα να δρουν με μείωση του υπάρχοντος θειοθειικού νατρίου, σχηματίζοντας θειώδες άλας και υδρόθειο (Η₂S).

Το τελευταίο είναι ένα άχρωμο αέριο, αλλά όταν αντιδρά με το άλας σιδήρου σχηματίζει μεταλλικό σίδηρο σιδήρου, το οποίο είναι μια αδιάλυτη ένωση (ορατό μαύρο ίζημα).

Ωστόσο, η ικανότητα του σχηματισμού Η₂S με αυτό το μέσο δεν είναι πολύ αξιόπιστο, διότι ορισμένα αρνητικά βακτήρια αποκαρβοξυλάσης λυσίνης ικανά να παράγουν Η₂S δεν θα σχηματίσει το μαύρο ίζημα, επειδή η οξύτητα του μέσου παρεμβαίνει. Συνεπώς συνιστάται να ελέγχετε με άλλα μέσα που περιέχουν σίδηρο.

Ερμηνεία της δοκιμής

Αποκαρβοξυλίωση της λυσίνης

Οι σωλήνες θα πρέπει να διαβάζονται μετά το τέλος των 24 ωρών επώασης, διαφορετικά υπάρχει ο κίνδυνος παρερμηνείας της αντίδρασης, η αναφορά ψευδών αρνητικών.

Πρέπει να θυμόμαστε ότι η πρώτη αντίδραση που θα προκύψει θα είναι η ζύμωση της γλυκόζης, επομένως όλοι οι σωλήνες μετά από 10 έως 12 ώρες θα γίνουν κίτρινοι.

Εάν στο τέλος της περιόδου επώασης (24 ώρες) παρατηρείται κίτρινο φόντο με μωβ ή μωβ επιφάνεια, η αντίδραση είναι αρνητική. Το μοβ χρώμα της επιφάνειας αντιστοιχεί στην αλκαλοποίηση του μέσου με τη χρήση πεπτονών.

Μια θετική αντίδραση είναι αυτή στην οποία ο πυθμένας και η επιφάνεια του σωλήνα είναι εντελώς μοβ, δηλαδή επιστρέφει στο αρχικό χρώμα.

Επομένως, ποιος καθορίζει τη θετικότητα της δοκιμής είναι η βάση ή ο πυθμένας του μέσου. Εάν έχετε αμφιβολίες σχετικά με το χρώμα, μπορείτε να το συγκρίνετε με ένα μη εμβολιασμένο σωλήνα LIA.

Αφαίρεση της λυσίνης

Ένας σωλήνας που αποδεικνύει την απομάκρυνση της λυσίνης θα έχει μια κοκκινωπή-καφέ επιφάνεια και ένα κίτρινο φόντο (οξύ) ή ολόκληρο το κοκκινωπό-καφέ σωλήνα..

Αυτή η αντίδραση ερμηνεύεται ως αρνητική για την αποκαρβοξυλίωση της λυσίνης, αλλά θετική για την απομάμωση της λυσίνης.

Αυτή η αντίδραση ορίζεται και ερμηνεύεται στην κλίση.

Παραγωγή υδρόθειου (Η₂S)

Μια θετική αντίδραση παρατηρείται από την εμφάνιση ενός μαύρου ιζήματος σε όλο ή μέρος του μέσου. Γενικά ανάμεσα στο όριο της λοξοτομής και τη βάση.

Αν το ίζημα εμφανιστεί σε ολόκληρο το σωλήνα, δεν θα εμφανιστούν οι άλλες αντιδράσεις που εμφανίζονται στο μέσο.

Καταγραφή των αποτελεσμάτων

Κατά την ερμηνεία της δοκιμής τα αποτελέσματα καταγράφονται ως εξής:

Αρχικά διαβάστε την κλίση, στη συνέχεια το κάτω μέρος ή taco, στη συνέχεια την παραγωγή του H₂S, και τελικά παραγωγή αερίου.

Παράδειγμα: K / A + (-). Αυτό σημαίνει:

• K: Αλκαλική στεφάνη (μοβ)
• Α: Οξύ (κίτρινο) υπόβαθρο, δηλαδή αρνητική αντίδραση αποκαρβοξυλίωσης και αρνητική αφομοίωση.
• +: Παραγωγή υδρόθειου
• (-): Χωρίς αέριο.

Προετοιμασία

Ζυγίζονται 35 γρ. Αφυδατωμένου σιδήρου άγαρ λυσίνης και διαλύονται σε ένα λίτρο απεσταγμένου νερού.

Θερμάνετε μέχρι να διαλυθεί πλήρως το άγαρ, ώστε να το βράσει για ένα λεπτό ανάδευση συχνά. Διανείμετε 4 ml του μέσου σε δοκιμαστικούς σωλήνες 13/100 με βαμβάκι.

Αποστειρώστε σε αυτόκλειστο στους 121 ° C για 15 λεπτά. Αφαιρέστε από το αυτόκλειστο και αφήστε να ξεκουραστεί με κλίση, έτσι ώστε να υπάρχει μια βαθιά βάση και μια μικρή κλίση.

Φυλάσσετε σε ψυγείο 2-8 ° C. Αφήστε να κρυώσει πριν φτιάξετε το βακτηριακό στέλεχος.

Το χρώμα του αφυδατωμένου μέσου είναι μπεζ και το μέσο παρασκευάζεται κοκκινωπό μωβ χρώμα.

Το τελικό ρΗ του παρασκευασθέντος μέσου είναι 6,7 ± 0,2.

Το μέσο γίνεται κίτρινο με ρΗ ίσο ή μικρότερο από 5,2 και πορφυρό σε ρΗ 6,5.

Χρησιμοποιεί

Η δοκιμή αυτή, μαζί με άλλες βιοχημικές εξετάσεις, χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση βακίλλων από την οικογένεια Enterobacteriaceae..

Το μέσον σπέρνεται με ευθύγραμμο βρόχο ή βελόνα, στον πυθμένα του σωλήνα τοποθετούνται ένας ή δύο διατρήσεις και στη συνέχεια η επιφάνεια του μέσου είναι ζιγκ-ζαγκ.

Επωάζεται επί 24 ώρες στους 35-37 ° C σε αερόβιο. Εάν είναι απαραίτητο, αφήνεται επώαση για 24 ώρες περισσότερο.

Είναι κυρίως χρήσιμο να διαφοροποιηθούν τα αρνητικά είδη λακτόζης Citrobacter Salmonellas sp.

Αναφορές

1. Mac Faddin Ι. (2003). Βιοχημικές δοκιμές για την ταυτοποίηση βακτηρίων κλινικής σημασίας. 3η έκδοση. Συντάκτης Panamericana. Μπουένος Άιρες Αργεντινή.
2. Forbes Β, Sahm D, Weissfeld Α. (2009). Μικροβιολογική διάγνωση της Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Αργεντινή.
3. Koneman Ε, Allen S, Janda W, Schreckenberger Ρ, Winn W. (2004). Μικροβιολογική διάγνωση. 5η έκδοση. Editorial Panamericana S.A. Αργεντινή.
4. Εργαστήρια Βρετανίας. Άγαρ σιδήρου λυσίνης. 2015. Διατίθεται στη διεύθυνση: britanialab.com
5. BD Laboratories BBL Lysine Iron Agar Slants. 2007. Διαθέσιμο στη διεύθυνση: bd.com
6. Valtek Laboratories Medium L.I.A. 2009. Διαθέσιμο στη διεύθυνση: andinamedica.com