Το άγαρ έχει βασική βάση, προετοιμασία και χρήσεις

Το τυπικό άγαρ λογαριασμού είναι ένα στερεό, μη εκλεκτικό μέσο καλλιέργειας, σχεδιασμένο για την ποσοτικοποίηση του αερόβιου μικροβιακού φορτίου που υπάρχει στα δείγματα πόσιμου νερού, λυμάτων, ποτών γάλακτος, μεταξύ άλλων τροφίμων. Αυτό το μέσο είναι επίσης γνωστό ως PCA άγαρ, για το ακρωνύμιο του στο αγγλικό Plate Count Agar. Δημιουργήθηκε το 1953 από τους Buchbinder, Baris και Goldstein.

Το πρότυπο υπόστρωμα μέσου άγαρ αποτελείται από εκχύλισμα ζυμομυκήτων, τριθενίνη, γλυκόζη, άγαρ και απεσταγμένο νερό. Αυτή η διατύπωση περιέχει βασικά θρεπτικά στοιχεία που επιτρέπουν την ανάπτυξη του παρόντος αερόβιου μικροβιακού φορτίου, όχι απαιτητικό.

Καθώς το μέσο δεν περιέχει αναστολείς, τα βακτηρίδια μπορούν να αναπτυχθούν χωρίς περιορισμούς, επομένως είναι ιδανικά για τον γενικό αριθμό αποικιών. Ωστόσο, η τεχνική ποσοτικού προσδιορισμού των πλακών δεν θα ανιχνεύσει όλα τα υπάρχοντα βακτηρίδια, αλλά μόνο εκείνα που είναι ικανά να αναπτυχθούν κάτω από τις περιβαλλοντικές συνθήκες στις οποίες υποβάλλεται το τυπικό άγαρ σποράς..

Εδώ, η πλάκα τεχνική κβαντισμού επιδιώκει να προσδιορίσει γενικά το ποσό των βακτηρίων μεσόφιλα αερόβια τύπου, δηλαδή αυτών που διεξάγονται σε θερμοκρασίες μεταξύ 25 και 40 ° C, με μία βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης στους 37 ° C.

Αυτή η βακτηριακή ομάδα είναι πολύ σημαντική, επειδή υπάρχουν τα περισσότερα από τα παθογόνα βακτήρια για τον άνθρωπο.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι μερικές φορές μπορεί να είναι ενδιαφέρον να ποσοτικοποιηθεί η ποσότητα των ψυχοφιλικών βακτηρίων που υπάρχουν στα τρόφιμα. Αυτά τα βακτήρια είναι αυτά που αναπτύσσονται σε χαμηλές θερμοκρασίες (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.

Παρομοίως, θερμόφιλα βακτήρια, τα οποία αναπτύσσονται σε περιοχή μεταξύ 50 ° C και 80 ° C ή περισσότερο, μπορεί να είναι σημαντικά σε ορισμένα είδη τροφίμων όπως κονσερβοποιημένα.

Η ποσοτικοποίηση μικροβίων εκφράζεται σε μονάδες σχηματισμού αποικιών (CFU) ανά γραμμάριο ή χιλιοστόλιτρο δείγματος.

Ευρετήριο

• 1 Ίδρυμα
• 2 Προετοιμασία
  • 2.1 Για την τεχνική της πλάκας
  • 2.2 Για φύτευση επιφανείας
• 3 Χρήση
  • 3.1 Τεχνική χύτευσης πλακών (σπόρο προς βάθος)
  • 3.2 Τεχνική που σπέρνεται στην επιφάνεια
• 4 Έλεγχος ποιότητας
• 5 Περιορισμοί
• 6 Αναφορές

Ίδρυμα

Ο μέσος τυπικός λογαριασμός έχει σχεδιαστεί για να επιτρέπει ικανοποιητική ανάπτυξη nonfastidious αερόβια βακτηρίδια όπως εκχύλισμα ζύμης, τρυπτικάσης και την γλυκόζη παρέχουν τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά για την καλή μικροβιακή ανάπτυξη.

Από την άλλη πλευρά, το μέσο έχει ένα διαυγές χρώμα και μια διαφανή εμφάνιση, γι 'αυτό είναι ιδανικό για την εμφάνιση των αποικιών που αναπτύσσονται με τη μέθοδο της βαθιάς σποράς (χύνοντας σε ένα πιάτο).

Είναι επίσης δυνατό να μετρήσουμε τις αποικίες με τη μέθοδο της σποράς στην επιφάνεια με μια σπάτουλα του Drigalski.

Όταν το μικροβιακό φορτίο είναι υψηλό, πρέπει να γίνονται δεκαδικές αραιώσεις του υπό μελέτη δείγματος προκειμένου να μετρηθούν οι CFU.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αυτό το μέσο συνιστάται από την Αμερικανική Ένωση Δημόσιας Υγείας (APHA) για την καταμέτρηση αερόβιων μεσοφιλίων.

Προετοιμασία

Ζυγίζονται 23,5 γρ. Του αφυδατωμένου μέσου και διαλύονται σε ένα λίτρο απεσταγμένου νερού. Για να διαλύσει τελείως το μείγμα πρέπει να αναδεύεται συχνά μέχρι να βράσει. Τα βήματα που ακολουθούν εξαρτώνται από την τεχνική σποράς που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί.

Για την τεχνική της πλάκας

Διανέμετε με διανομή 12 έως 15 ml σε δοκιμαστικούς σωλήνες. Στη συνέχεια αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο στους 121 ° C για 15 λεπτά. Αφήστε να στερεοποιηθεί κάθετα με τη μορφή μπλοκ. Φυλάσσετε στο ψυγείο μέχρι τη χρήση.

Λιώνουμε τη λέξη όταν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί. Μόλις λειώσει, κρατήστε το σε λουτρό νερού στους 44-47 ° C ενώ προετοιμάζονται τα δείγματα.

Για φύτευση στην επιφάνεια

Αποστειρώστε το μέσο σε αυτόκλειστο στους 121 ° C και στη συνέχεια διανείμετε 20 ml σε στείρα τρυβλία Petri. Αφήστε να στερεοποιηθεί, να αναστραφεί και να αποθηκευτεί σε ψυγείο μέχρι τη χρήση.

Ζεστάνετε τις πλάκες πριν τη χρήση. Το ρΗ του μέσου θα πρέπει να είναι 7,0 ± 0,2.

Χρήση

Η μέτρηση πρότυπου άγαρ χρησιμοποιείται στην τεχνική αερόβιας μέτρησης μεσοφυλλίων κατά τη διάρκεια της μικροβιολογικής ανάλυσης νερού και τροφής. Η μέτρηση των αερόβιων μεσόφιλων είναι απαραίτητη, καθόσον καθορίζει την υγειονομική ποιότητα του υπό μελέτη δείγματος.

Η εφαρμογή αυτής της τεχνικής (με τη χρήση αυτού του μέσου) επιτρέπει τη μακροσκοπική απεικόνιση απομονωμένων αποικιών για την ποσοτικοποίησή τους.

Τεχνική χύτευσης πλάκας (σπόρο από βάθος)

-Διαδικασία

Η τεχνική αποτελείται από τα ακόλουθα:

1) Ομογενοποιήστε το δείγμα για να αναδιανείμετε τα υπάρχοντα βακτηρίδια.

2) Ένα αρχικό εναιώρημα διεξάγεται σε ένα στείρο φιαλίδιο ή σάκο, τηρώντας την αναλογία 10 g ή 10 ml δείγματος σε 90 ml διαλύτη (10^-1).

3) Από την αρχική αναστολή πραγματοποιούνται οι σχετικές δεκαδικές αραιώσεις ανάλογα με τον τύπο του δείγματος. Παράδειγμα: (10^-2, 10^-3, 10^-4). Οι αραιώσεις παρασκευάζονται με νερό πεπτόνης ή φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα.

Για να γίνει αυτό, πάρτε 1 ml του αρχικού εναιωρήματος και τοποθετήστε τα σε 9 ml αραιωτικού, συνεχίστε τις αραιώσεις εάν είναι απαραίτητο, λαμβάνοντας τώρα 1 ml της αραίωσης.^-2 και ούτω καθεξής.

4) Πάρτε 1 ml από κάθε αραίωση και τοποθετήστε τα σε κενά αποστειρωμένα πιάτα Petri.

5) Προσθέστε σε κάθε τρυβλίο 12 έως 15 ml αγαρ πρότυπου μέτρησης που έχει προηγουμένως τηχθεί και ρυθμίστηκε στους 44 - 47 ° C.

6) Δώστε ομαλές περιστροφικές κινήσεις στις πλάκες για να κατανείμετε το δείγμα στο άγαρ ομοιόμορφα και αφήστε να στερεοποιηθεί.

7) Αναστρέψτε τις πλάκες και επωάστε στους 37 ° C σε αερόβιοση για 24 έως 48 ώρες.

8) Μόλις ολοκληρωθεί ο χρόνος, προχωρήστε στην εξέταση των πλακών και μετρήστε τις αποικίες στην αραίωση που το επιτρέπει. Επιλέγεται για την καταμέτρηση εκείνων των πλακών που έχουν μεταξύ 30 και 300 CFU.

Η μέτρηση μπορεί να γίνει με το χέρι ή μπορεί να χρησιμοποιηθεί ο μετρητής αποικιών.

Οι επιτρεπόμενες τιμές ανά ml δείγματος μπορεί να διαφέρουν από χώρα σε χώρα σύμφωνα με τα πρότυπα βάσει των οποίων διέπονται.

-Υπολογισμός του UFC

Ο γενικός υπολογισμός γίνεται με τον ακόλουθο τύπο:

Εκφράστε τα αποτελέσματα σε 1 ή 2 ψηφία, πολλαπλασιάζοντας την κατάλληλη βάση 10. Παράδειγμα: εάν το αποτέλεσμα είναι 16.545, στρογγυλοποιείται με βάση το τρίτο ψηφίο σε 17.000 και θα εκφράζεται ως εξής: 1,7 x 10⁴. Τώρα, εάν το αποτέλεσμα ήταν 16.436 στρογγυλοποιείται σε 16.000 και εκφράζεται 1.6 x 10⁴.

Τεχνική φυτεμένη στην επιφάνεια

-Διαδικασία

-Ενοφθαλμίστε με 0,1 ml του άμεσου δείγματος εάν είναι υγρό, αρχικό εναιώρημα 10^-1 ή διαδοχικών αραιώσεων 10^-2, 10^-3 κ.λπ., στη μέση μιας τυπικής πλάκας άγαρ λογαριασμού.

-Διανείμετε το δείγμα ομοιόμορφα με σπάτουλα Drigalski ή γυάλινη ράβδο σε σχήμα L. Αφήνουμε να σταθεί για 10 λεπτά.

-Αναστρέψτε τις πλάκες και επωάστε σε αερόβιοση στους 37 ° C για 24 έως 48 ώρες.

-Συνεχίστε να υπολογίζετε τις αποικίες, επιλέξτε αυτές τις πλάκες που κυμαίνονται μεταξύ 20 - 250 CFU.

-Υπολογισμός του UFC

Για τον υπολογισμό εφαρμόζεται ο συντελεστής αραίωσης, ο οποίος είναι αντίστροφος. Ο αριθμός στρογγυλοποιείται σε 2 σημαντικά ψηφία (στρογγυλοποίηση σύμφωνα με το τρίτο ψηφίο) και εκφράζεται σε ισχύ βάσης 10. Για παράδειγμα, εάν στο δείγμα μετρήθηκαν 224 CFU χωρίς αραίωση (10^-1), Αναφέρεται 22 x 10¹  UFC, αλλά αν ο αριθμός ήταν 225, αναφέρεται 23 x 10¹ UFC.

Τώρα, αν μετρήσετε 199 CFU σε αραίωση 10^-3, 20 x 10 θα αναφέρονται⁴ UFC, αλλά αν 153 CFU μετριούνται στην ίδια αραίωση, θα αναφέρονται 15 x 10⁴ UFC.

Έλεγχος ποιότητας

Το πρότυπο μέσο καλλιέργειας μέτρησης μπορεί να αξιολογηθεί χρησιμοποιώντας γνωστά πιστοποιημένα στελέχη, όπως: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Εάν το μέσο καλλιέργειας βρίσκεται σε βέλτιστες συνθήκες, αναμένεται ικανοποιητική ανάπτυξη σε όλες τις περιπτώσεις, με εξαίρεση το L. fermentum που μπορεί να έχει τακτική απόδοση.

Για να εκτιμηθεί η στειρότητα του μέσου καλλιέργειας, μία ή δύο πλάκες από κάθε παρασκευασμένη παρτίδα (μη εμβολιασμένη) θα πρέπει να επωάζονται στους 37 ° C σε αερόβιοση για 24 ώρες. Στο τέλος αυτού του χρονικού διαστήματος, δεν πρέπει να παρατηρηθεί ανάπτυξη ή αλλαγή χρώματος του μέσου..

Περιορισμοί

-Μην λειάζετε το άγαρ περισσότερο από μία φορά.

-Το έτοιμο μέσο μπορεί να διαρκέσει έως και 3 μήνες, εφόσον διατηρείται σε ψυγείο και προστατεύεται από το φως.

-Αυτό το μέσο δεν είναι κατάλληλο για απαιτητικούς μικροοργανισμούς, ούτε αναερόβια.

Αναφορές

1. Εθνική Διοίκηση Φαρμάκων Τροφίμων και Ιατρικής Τεχνολογίας (ANMAT). Μικροβιολογική ανάλυση τροφίμων, επίσημη αναλυτική μεθοδολογία, δείκτες μικροοργανισμών. 2014 Τόμος 3. Διατίθεται στη διεύθυνση: anmat.gov.ar
2. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories, S.A. Πιάτο Agar. 2009. Διατίθεται στη διεύθυνση: http://f-soria.es
3. Εργαστήρια Conda Pronadisa. Agar για τυποποιημένες μεθόδους (PCA) σύμφωνα με το APHA και ISO 4833. Διατίθεται στη διεύθυνση: condalab.com
4. Εργαστήρια Βρετανίας. Μετρώντας την πλάκα άγαρ. 2015. Διατίθεται στη διεύθυνση: britanialab.com
5. Camacho Α, Giles Μ, Ortegón Α, Palao Μ, Serrano Β και Velázquez Ο. 2009. Τεχνικές για τη μικροβιολογική ανάλυση των τροφίμων. 2η έκδοση. Τμήμα Χημείας, UNAM. Μεξικό Διατίθεται στο: depa.fquim.unam