Voges-Proskauer ίδρυμα δοκιμών, προετοιμασία και χρήσεις

Το Δοκιμή Voges-Proskauer είναι μια βιοχημική δοκιμασία που χρησιμοποιείται για να βοηθήσει στην ταυτοποίηση βακτηρίων που ανήκουν στην οικογένεια Enterobacteriaceae. Ειδικά είναι χρήσιμο να διαφοροποιηθούν τα στελέχη του Escherichia coli του Klebsiella και Enterobacter, μεταξύ άλλων.

Η δοκιμή διεξάγεται στο υγρό μέσο καλλιέργειας που ονομάζεται methyl red-Voges Proskauer, περισσότερο γνωστό από το ακρωνύμιο RM / VP. Αυτό το μέσο αποτελείται από ρυθμισμένη πολυπεπτόνη, γλυκόζη, φωσφορικό κάλιο και απεσταγμένο νερό.

Το τρέχον μέσο RM / VP είναι μια τροποποίηση του μέσου Clark και Lubs, το οποίο αρχικά περιείχε χαμηλότερη συγκέντρωση πεπτονών και γλυκόζης. Ως εκ τούτου, παράχθηκε λιγότερα ιόντα υδρογόνου, που απαιτούνται για τη θετική αντίδραση Voges-Proskauer.

Η δοκιμή βασίζεται στην ικανότητα του μικροοργανισμού να χρησιμοποιεί γλυκόζη μέσω της οδού βουτυλενικής γλυκόλης και σχηματίζει ένα ουδέτερο τελικό προϊόν που ονομάζεται ακετοΐνη, παρουσία οξυγόνου και ενός αλκαλικού ρΗ.

Στο μέσο RM / VP, πέραν του ότι ήταν σε θέση να αποκαλύψει τη δοκιμασία Voges-Proskauer, μπορεί επίσης να αποκαλυφθεί η δοκιμή κόκκινου μεθυλίου.

Ευρετήριο

• 1 Ίδρυμα
  • 1.1 Βάση της δοκιμής Voges-Proskauer
  • 1.2 Βάση για την ανάπτυξη της δοκιμής και της ερμηνείας
• 2 Προετοιμασία
  • 2.1 Μεσαία RM / VP
  • 2.2 Voges Ένα αντιδραστήριο
  • 2.3 Αντιδραστήριο Voges Β
• 3 Διαδικασία της δοκιμής Voges-Proskauer
  • 3.1 Ανάπτυξη της δοκιμής
• 4 Χρήση
• 5 Έλεγχος ποιότητας
• 6 Αναφορές

Ίδρυμα

Βάση της δοκιμής Voges-Proskauer

Τα πολυπεπτόνια που υπάρχουν στο μέσο παρέχουν τις διατροφικές απαιτήσεις που είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη των βακτηρίων. Από τη μεριά του, η γλυκόζη είναι η κύρια ένωση. Πολλά βακτηρίδια έχουν τη δυνατότητα να μεταβολίζουν τη γλυκόζη και να σχηματίζουν πυροσταφυλικό οξύ.

Το πυροσταφυλικό οξύ είναι ένα μεσαίο σημείο στον μεταβολισμό της γλυκόζης και από εκεί κάθε μικροοργανισμός μπορεί να πάρει διαφορετικές οδούς. Κάποιοι θα σχηματίσουν μικτά οξέα, όπως γαλακτικό οξύ, οξικό οξύ, μυρμηκικό οξύ και ηλεκτρικό οξύ και άλλα θα σχηματίσουν ουδέτερα προϊόντα όπως 2,3-βουτανοδιόλη.

Η δοκιμασία Voges-Proskauer αποκαλύπτει την ικανότητα του μικροοργανισμού να σχηματίζει ακετυλομεθυλοκαρβινόλη (ακετοΐνη), ένα ενδιάμεσο προϊόν 2,3-βουτανοδιόλης υπό αερόβιες συνθήκες.

Η ακετοΐνη ανάγεται και σχηματίζει 2,3-βουτανοδιόλη, αλλά αυτή η αντίδραση είναι αναστρέψιμη, έτσι εάν οξειδώνεται η 2,3-βουτανοδιόλη, σχηματίζεται ακετοΐνη. Επομένως, το οξυγόνο είναι απαραίτητο.

Το φωσφορικό δι-κάλιο είναι το ρυθμιστικό διάλυμα που υγραίνει το μίγμα σε ρΗ 6,9 ± 0,2..

Βάση για την ανάπτυξη της δοκιμής και της ερμηνείας

Για να αποδειχθεί η αντίδραση, πρέπει να πραγματοποιηθεί ανάπτυξη χρησιμοποιώντας δύο αντιδραστήρια (αντιδραστήρια Barrit), γνωστά ως Voges Α και Voges Β.

Το Voges Α είναι ένα διάλυμα 5% α-ναφθόλης και το Voges Β είναι ένα παρασκεύασμα υδροξειδίου του καλίου 40%. Αν δεν είναι διαθέσιμο το υδροξείδιο του καλίου, μπορεί να αντικατασταθεί με 40% υδροξείδιο του νατρίου.

Η Α-ναφθόλη είναι ένας καταλύτης που θα αυξήσει την ένταση του χρώματος της αντίδρασης, γεγονός που καθιστά τη δοκιμή πιο ευαίσθητη. Η α-ναφθόλη πρέπει πάντα να προστίθεται πρώτα, ανακατεύοντας τον σωλήνα έτσι ώστε το μέσο έρχεται σε επαφή με το οξυγόνο. Με τον τρόπο αυτό η παρούσα ακετοΐνη οξειδώνεται σε διακετύλιο και η 2,3-βουτανοδιόλη οξειδώνεται για να σχηματίσει ακετοϊνη, διαβιβάζοντάς την σε διακετύλιο.

Αυτός είναι ο τρόπος με τον οποίο η α-ναφθόλη θα δεσμεύεται με το διακετύλιο, το οποίο με τη σειρά του έχει συνδεθεί με τον πυρήνα γουανιδίνης που υπάρχει στο αμινοξύ αργινίνη, ο δε τελευταίος προέρχεται από τα πολυπεπτόνια.

Από την πλευρά του, το υδροξείδιο του καλίου ή του νατρίου είναι υπεύθυνο για την απορρόφηση του CO₂ και να αντιδράσουν με τις πεπτόνες. Αυτή η αντίδραση προκαλεί το σχηματισμό ενός χρώματος ροζ σολομού, εμφανώς ορατό μετά την ανακίνηση του σωλήνα πολύ καλά.

Προκειμένου ο χρωματισμός να συμβεί στιγμιαία, πρέπει να αναμειχθούν οι σωστές ποσότητες διακετυλίου, πεπτόνης και α-ναφθόλης. Εάν αυτό δεν συμβεί, αφήστε το σωλήνα να ξεκουραστεί για 15 λεπτά πριν από την ερμηνεία.

Συνήθως η δοκιμή είναι θετική μετά από 2 έως 5 λεπτά, όταν μπορεί να παρατηρηθεί ασθενές ροζ χρώμα. Αν παραμείνει σε ηρεμία για 30 λεπτά έως 1 ώρα, η ένταση του χρώματος θα είναι μέγιστη (βαθιά κόκκινη).

Μια αρνητική δοκιμή θα είναι εμφανής όταν ο ζωμός είναι κίτρινος. Μετά από 1 ώρα, εάν η δοκιμή είναι αρνητική, μπορεί να σχηματιστεί χρώμα χαλκού ως αποτέλεσμα της αντίδρασης υδροξειδίου του καλίου σε α-ναφθόλη.

Προετοιμασία

Μεσαίο RM / VP

Ζυγίζονται 17 g του αφυδατωμένου μέσου καλλιέργειας και διαλύονται σε ένα λίτρο απεσταγμένου νερού. Αφήστε να σταματήσετε για 5 λεπτά. Θερμάνετε μέχρι να βράσει για να διαλυθεί εντελώς. Σερβίρετε 3 έως 4 ml σε σωλήνες και αποστειρώστε σε αυτόκαυστο στους 121 ° C για 15 λεπτά.

Το αφυδατωμένο μέσο καλλιέργειας είναι μπεζ και το μέσο που παρασκευάζεται είναι φως κεχριμπαριού.

Το τελικό ρΗ του μέσου είναι 6,9 ± 0,2.

Voges Ένα αντιδραστήριο

Ζυγίζονται 5 g α-ναφθόλης και διαλύονται σε 50 ml αιθυλικής αλκοόλης (απόλυτη). Στη συνέχεια συνεχίστε να προσθέτετε αιθυλική αλκοόλη για να συμπληρώσετε τα 100 ml.

Αντιδραστήριο Voges Β

Ζυγίζονται 40 g υδροξειδίου του καλίου και διαλύονται σε 50 ml αποσταγμένου νερού σε ποτήρι ζέσεως. Το γυαλί πρέπει να τοποθετηθεί σε λουτρό ψυχρού ύδατος για τον έλεγχο της θερμοκρασίας, διότι κατά τη στιγμή της διάλυσης του παρασκευάσματος αυξάνεται έντονα.

Αφού το διάλυμα ψυχθεί, μεταφέρεται σε βαθμονομημένο μπαλόνι και φέρεται στα 100 mL με αποσταγμένο νερό.

Διαδικασία της δοκιμής Voges-Proskauer

Για να εκτελεστεί η δοκιμή Voges-Proskauer, ένας ζωμός RM / VP εμβολιάζεται με τον υπό μελέτη μικροοργανισμό, από μια καθαρή καλλιέργεια 18 έως 24 ωρών.

Το ενοφθάλμισμα δεν πρέπει να είναι πολύ πυκνό. Επωάζεται στους 35-37 ° C για 24 έως 48 ώρες, αν και μερικές φορές η επώαση είναι απαραίτητη για αρκετές ημέρες. Η Cowan και ο χάλυβας πιστεύουν ότι οι 5 ημέρες είναι ο ελάχιστος χρόνος επώασης που απαιτείται για την ανίχνευση όλων των θετικών ειδών Voges-Proskauer (VP) της οικογένειας Enterobacteriaceae.

Ανάπτυξη της δοκιμής

Διαχωρίστε ένα δείγμα 1 mL σε ένα σωλήνα και εκτελέστε την ανάπτυξη ως ακολούθως: τοποθετήστε 12 σταγόνες (0,6 mL) αντιδραστηρίου Voges A και 4 σταγόνες (0,2 mL) του Voges B. Αναμείξτε για να αερίσετε και αφήστε το να σταθεί για 5 - 10 λεπτά πριν την εκτέλεση. Ωστόσο, αν η δοκιμασία είναι ακόμα αρνητική αφήστε την να σταθεί και παρατηρήστε το σωλήνα μετά από 30 λεπτά έως 1 ώρα.

Η εμφάνιση ενός ροζ-κόκκινου χρώματος υποδεικνύει ότι η αντίδραση Voges-Proskauer είναι θετική. Εάν το μέσο παραμένει κίτρινο, η αντίδραση είναι αρνητική.

Η προσθήκη των προγραμματιστών με τη σειρά και την ποσότητα που αναφέρονται είναι απαραίτητη για την αποφυγή ψευδών αρνητικών.

Χρήση

Η δοκιμασία Voges-Proskauer είναι χρήσιμη για τη διαφοροποίηση μεταξύ των στελεχών του Ε. Coli που είναι VP αρνητικά, των γενών Klebsiella, Enterobacter, Serratia, μεταξύ άλλων, τα οποία είναι VP θετικά.

Έλεγχος ποιότητας

Τα στελέχη ελέγχου μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να ελέγξουν την ποιότητα του παρασκευασμένου μέσου. Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium και Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Τα αναμενόμενα αποτελέσματα είναι θετικές αντιδράσεις Voges-Proskauer μόνο για Κ. Pneumoniae και Ε. Cloacae. Τα υπόλοιπα δίνουν αρνητικές αντιδράσεις.

Αναφορές

1. Εργαστήρια Βρετανίας. Μέσο MR-VP. 2015. Διατίθεται στη διεύθυνση: www.britanialab.com
2. Εργαστήρια Microkit M-Ident Voges Proskauer. 2014. Διαθέσιμο: http://www.medioscultivo.com
3. Mac Faddin Ι. (2003). Βιοχημικές δοκιμές για την ταυτοποίηση βακτηρίων κλινικής σημασίας. 3η έκδοση. Συντάκτης Panamericana. Μπουένος Άιρες Αργεντινή.
4. Forbes Β, Sahm D, Weissfeld Α. (2009). Μικροβιολογική διάγνωση της Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Αργεντινή.
5. Koneman Ε, Allen S, Janda W, Schreckenberger Ρ, Winn W. (2004). Μικροβιολογική διάγνωση. 5η έκδοση. Editorial Panamericana S.A. Αργεντινή.