Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας του DNA Maxam-Gilbert, μέθοδος Sanger, παραδείγματα

Το Αλληλουχία DNA (δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ) είναι μια διαδικασία που διεξάγεται σε εργαστήρια μοριακής βιολογίας που επιτρέπει την γνώση της σειράς νουκλεοτιδίων στο γενετικό υλικό που μας ενδιαφέρει. Επιπλέον, η αλληλουχία του RNA (ριβονουκλεϊκό οξύ) μπορεί επίσης να αποκαλυφθεί.

Αυτή η τεχνική ήταν απαραίτητη για την ανάπτυξη των βιολογικών επιστημών. Εφαρμόζεται επίσης σε άλλα πεδία γνώσης - όπως ιατρική διάγνωση και ιατροδικαστικές έρευνες, για παράδειγμα.

Προηγουμένως, η αλληλούχιση ενός κλώνου DNA θεωρήθηκε αργή και δαπανηρή δραστηριότητα, η οποία επέτρεψε την ταυτοποίηση μόνο μερικών ζευγών βάσεων στα ολιγονουκλεοτίδια.

Σήμερα, με όλες τις προόδους της επιστήμης, της αλληλουχίας του DNA είναι μια συνηθισμένη ενέργεια σε πολλά εργαστήρια σε όλο τον κόσμο χάρη στη συμβολή των σχεδόν 50 χρόνια έρευνας στον τομέα αυτό. Καθώς το μήκος της αλυσίδας, μπορούν να αλληλουχούνται σε εκατομμύρια ζευγών βάσεων σε σύντομο χρονικό διάστημα.

Για να γίνει αυτό, υπάρχουν δεκάδες τεχνικές που αναπτύσσονται με διαφορετική τιμή και ακρίβεια. Σε αυτό το άρθρο, θα περιγράψουμε τόσο τις κλασσικές όσο και τις σύγχρονες τεχνικές, με τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματά του.

Μέχρι στιγμής, οι τεχνικές αλληλούχησης επιτρέπουν την απόκτηση της αλληλουχίας πλήρων γονιδιωμάτων, από μικρούς προκαρυώτες και ζυμομύκητες έως το ανθρώπινο γονιδίωμα.

Ευρετήριο

• 1 Δομή του DNA
• 2 Ιστορία
• 3 μέθοδος Sanger
  • 3.1 Κύρια συστατικά της αντίδρασης
  • 3.2 Ανάγνωση των αποτελεσμάτων
• 4 Αυτόματη ανάλυση αλληλουχίας
• 5 αλληλούχηση Maxam-Gilbert
  • 5.1 Διαδικασία
  • 5.2 Ανάγνωση των αποτελεσμάτων
• 6 Μαζική αλληλούχιση
  • 6.1 Pyrosequencing
  • 6.2 Ακολουθία με σύνθεση
  • 6.3 Ακολουθία με σύνδεση
  • 6.4 Ακολουθία ιόντων Torrent
• 7 Παραδείγματα
  • 7.1 Η αλληλουχία του ανθρώπινου γονιδιώματος
• 8 Σημασία και εφαρμογές
• 9 Αναφορές

Δομή του DNA

Για να κατανοηθούν οι μέθοδοι και οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την αλληλούχιση του DNA, είναι απαραίτητο να γνωρίζουμε ορισμένες βασικές πτυχές της δομής και της σύνθεσης του μορίου.

Το DNA είναι ένα βιομόριο που βρίσκεται σε όλα τα έμβια όντα, από τα βακτήρια έως τα μεγάλα υδρόβια ζώα. Τα οργανίδια όπως τα μιτοχόνδρια και οι χλωροπλάστες έχουν ένα κυκλικό μόριο DNA μέσα τους. Ακόμη και σε ορισμένους ιούς, το γενετικό υλικό που βρέθηκε είναι ϋΝΑ.

Δομικά, το DNA είναι ένα σύνολο νουκλεοτιδίων. Κάθε μία ενσωματώνεται από έναν υδατάνθρακα, μια βάση αζώτου (Α, Τ, C ή G) και μια ομάδα φωσφορικών. Ο στόχος της αλληλούχησης του DNA είναι να αποκαλυφθεί η σειρά με την οποία βρίσκονται οι τέσσερις αζωτούχες βάσεις στην ακολουθία.

Ιστορία

Στα μέσα της δεκαετίας του 1950, οι ερευνητές Watson και Crick περιέγραψαν τη δομή του DNA χρησιμοποιώντας χριστολογικές τεχνικές. Ωστόσο, κανένας από αυτούς τους ερευνητές δεν μπόρεσε να βρει έναν τρόπο να αποκαλύψει την ακολουθία.

Αν και υπήρχαν κάποιοι προκάτοχοί, το πιο σημαντικό γεγονός ήταν η δημιουργία της μεθόδου Sanger, το 1977. Frederick Sanger, ο πατέρας της μεθόδου ήταν ένας Βρετανός βιοχημικός, νικητής των δύο βραβεία Νόμπελ για την τεράστια συμβολή τους στις βιολογικές επιστήμες.

Αυτή η τεχνική είναι επίσης γνωστή στη βιβλιογραφία ως "τερματισμός αλυσίδας" ή διδεοξυνουκλεοτίδια. Στη συνέχεια θα περιγράψουμε τις αρχές αυτής της τεχνικής και αυτές που αναπτύχθηκαν με βάση τη βελτίωση και την καινοτομία.

Η μέθοδος του Sanger

Η ανάπτυξη της μεθόδου Sanger αντιπροσώπευε ένα κρίσιμο γεγονός στη μοριακή βιολογία. Περιλαμβάνει τα βασικά συστατικά της διαδικασίας αντιγραφής του DNA που συμβαίνει κανονικά στο κύτταρο, αλλά με την προσθήκη ενός ειδικού συστατικού: διδεοξυνουκλεοτίδια.

Κύρια συστατικά της αντίδρασης

- πολυμεράση DNA: ένζυμο DNA πολυμεράση είναι μια κρίσιμη διαδικασία στοιχεία. Αυτό το μόριο εμπλέκεται στην αντιγραφή του κλώνου DNA και ο ρόλος του είναι η σύνθεση της νέας αλυσίδας, που ταιριάζουν με συμπληρωματικές τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια.

Υπενθυμίζουμε ότι το DNA θυμίνη (Τ) ζευγαρώνουν με αδενίνες (Α) μέσω δύο δεσμών υδρογόνου, ενώ κυτοσίνη (C) καθιστά με γουανίνη (G) από τρεις γέφυρες.

- αλληλούχιση Νουκλεοτίδια Sanger περιλαμβάνει δύο τύπους νουκλεοτιδίων, 2'-δεοξυνουκλεοτίδια τέσσερις (συντετμημένο ως dATP, dGTP, dTTP και dCTP) και οι τέσσερις διδεοξυνουκλεοτίδια (ddATP, ddGTP, ddCTP και ddTTP) Ειδική.

Αν και τα διδεοξυνουκλεοτίδια είναι παρόμοια με τα μονομερή που κανονικά ενσωματώνονται στο ϋΝΑ, δεν έχουν ομάδα -ΟΗ στη δομή τους. Αυτό καθιστά αδύνατη την προσθήκη ενός νέου νουκλεοτιδίου στην αλυσίδα.

Επομένως, όταν ένα ειδικό νουκλεοτίδιο προστίθεται - με έναν εντελώς τυχαίο τρόπο - στην αλυσίδα που σχηματίζεται, η σύνθεση παραλύεται. Με τον τρόπο αυτό, στο τέλος της αντίδρασης, υπάρχουν αλυσίδες διαφορετικών μεγεθών, κάθε μία από τις οποίες η αντίδραση σταμάτησε σε διαφορετικό σημείο.

Πειραματικά, προετοιμάζονται τέσσερις δοκιμές. Κάθε μία περιέχει το ϋΝΑ που εξάγεται από το βιολογικό δείγμα ενδιαφέροντος, τα κανονικά νουκλεοτίδια και έναν από τους τέσσερις τύπους ειδικών νουκλεοτιδίων. Ή τα ειδικά νουκλεοτίδια σημειώνονται με κάποιο τύπο δείκτη φθορισμού (βλέπε παρακάτω αυτοματοποιημένη αλληλούχιση).

Ανάγνωση των αποτελεσμάτων

Το πρώτο βήμα είναι να διαχωριστεί καθεμία από τις συντιθέμενες αλυσίδες σύμφωνα με το μέγεθός τους. Μερικοί θα είναι μεγαλύτεροι από τους άλλους, ανάλογα με το πού ενσωματώθηκαν οι ειδικές βάσεις.

Υπάρχουν διάφορες βιοχημικές τεχνικές που επιτρέπουν τον διαχωρισμό των συστατικών ενός μείγματος χρησιμοποιώντας το μέγεθος ως ιδιότητα διάκρισης. Στη μέθοδο Sanger, οι διαφορετικές αλυσίδες διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση. Στις πιο εξελιγμένες παραλλαγές της τεχνικής χρησιμοποιείται τριχοειδής ηλεκτροφόρηση.

Έτσι, οι μακρύτεροι κλώνοι κινούνται λιγότερο από τις βραχύτερες παραλλαγές. Στη συνέχεια, το σύστημα αυτό περνά από έναν αναγνώστη που αναγνωρίζει το δείκτη που περιλαμβάνεται σε κάθε διδεσοξυνουκλεοτίδιο. Με αυτόν τον τρόπο, η σειρά της ακολουθίας μπορεί να είναι γνωστή.

Αυτή η τεχνική "πρώτης γενιάς" είναι ικανή να διαβάζει θραύσματα DNA όχι μεγαλύτερα από 1 kilobase. Προς το παρόν, η μέθοδος Sanger χρησιμοποιείται σε πολλά εργαστήρια, γενικά στις σύγχρονες παραλλαγές της. Επιπλέον, χρησιμοποιείται για να επιβεβαιώσει τα αποτελέσματα που έχουν αποκτηθεί με τις πιο πολύπλοκες τεχνικές - αλλά λιγότερο ακριβείς.

Αυτόματη ανάλυση αλληλουχίας

Όταν απαιτείται ανάλυση μεγάλης κλίμακας, η διαδικασία επιταχύνεται με αυτοματοποίηση. Πρόκειται για μια παραλλαγή της μεθόδου τερματισμού της αλυσίδας Sanger, όπου οι εκκινητές σημαίνονται με προϊόντα φθορισμού για να τα διακρίνουν.

Ακολούθως, το προϊόν της αντίδρασης διεξάγεται σε ηλεκτροφόρηση - όλα σε μία λωρίδα. Όταν κάθε θραύσμα φεύγει από το τελικό τμήμα της γέλης, ταυτοποιείται ταχέως από την φθορίζουσα ετικέτα του, με σφάλμα που περιβάλλει το 1%.

Τα πιο εξελιγμένα συστήματα διαθέτουν σύστημα μέχρι 96 τριχοειδών σωλήνων που λειτουργούν με υπολογιστή συνδεδεμένο με ρομπότ. Δηλαδή, 96 δείγματα DNA μπορούν να αξιολογηθούν ταυτόχρονα. Έτσι, η διαδικασία που περιλαμβάνει ηλεκτροφόρηση και η ανάλυση των αποτελεσμάτων είναι πλήρως αυτοματοποιημένη.

Σε μια μέρα, αυτά τα συστήματα μπορούν να αλληλουχούν έως και 550.000 βάσεις. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας, η ανθρώπινη δουλειά είναι περιττή, χρειάζεται μόνο περίπου 15 λεπτά για να ξεκινήσει η μέθοδος.

Ακολουθία από τον Maxam-Gilbert

Την ίδια στιγμή που ο Sanger δημοσίευσε το έργο του, δύο ερευνητές ονόμασαν τον Allan Maxan και τον Walter Gilbert να καταφέρνουν να αναπτύξουν μια άλλη μέθοδο για να αποκτήσουν την αλληλουχία DNA. Η μέθοδος κέρδισε δημοτικότητα την εποχή εκείνη, αλλά αργότερα εκτοπίστηκε από τη βελτίωση της μεθόδου Sanger.

Σε αντίθεση με τη μέθοδο του Sanger, η αλληλούχιση των Maxan και Gilbert (ή χημική αλληλούχιση, όπως είναι επίσης γνωστή) δεν περιλαμβάνει αντιδράσεις υβριδισμού. Η μεθοδολογία συνίσταται στη σήμανση με αντιδραστικούς παράγοντες στο ένα άκρο, ακολουθούμενη από μια διαδικασία καθαρισμού.

Μια από τις αρνητικές πτυχές αυτής της τεχνικής έγκειται στην τεράστια πολυπλοκότητά της και στη χρήση χημικών ουσιών που είναι επικίνδυνες για τον χρήστη. Οι χημικές καταστροφές προκαλούνται από την εφαρμογή DMS, μυρμηκικού οξέος, υδραζίνης και υδραζίνης με άλατα.

Διαδικασία

Το πρωτόκολλο ξεκινά με την επισήμανση στο άκρο 5 'του κλώνου με τον δείκτη φωσφόρου 32, κατόπιν λαμβάνει χώρα μία χημική τροποποίηση της αζωτούχου βάσης και διαχωρίζεται. Τελικά συμβαίνει η διάσπαση της περιοχής του αβασικού.

Πρώτα η αλυσίδα που πρόκειται να αναλυθεί ακολουθείται σε μικρότερα τμήματα. Αυτό το στάδιο πραγματοποιείται με ένζυμα περιορισμού, τα οποία οδηγούν σε εξαιρετικά ακραία αποτελέσματα.

Στη συνέχεια, η αντίδραση διεξάγεται με μια αλκαλική φωσφατάση, σκοπός της οποίας είναι η εξάλειψη της φωσφορικής ομάδας. Έτσι, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια πολυνουκλεοτιδική κινάση για την πραγματοποίηση της επισήμανσης.

Η αλυσίδα είναι μετουσιωμένη (οι δύο κλώνοι ανοίγουν). Στη συνέχεια θα προχωρήσουμε στην εφαρμογή των χημικών ουσιών. Αυτές οι αντιδράσεις διάσπασης γίνονται με ελεγχόμενο τρόπο και ποιοι τύποι δεσμών θραύονται από κάθε χημικό που εφαρμόζεται.

Ανάγνωση των αποτελεσμάτων

Όπως και στη μέθοδο Sanger, η ανάγνωση των αποτελεσμάτων περιλαμβάνει τον διαχωρισμό κατά μέγεθος των αλυσίδων που λαμβάνονται σε ένα σύστημα ηλεκτροφόρησης. Τα συστήματα που αποτελούνται από πολυακρυλαμίδιο επιτρέπουν την επίτευξη πολύ κατάλληλης ανάλυσης για την ανάγνωση της γέλης.

Μαζική αλληλούχιση

Η μαζική αλληλούχιση περιλαμβάνει μια σειρά καινοτόμων μεθόδων, που συντομογραφούνται ως NGS, από την αγγλική "Ακολουθία επόμενης γενιάς ".

Οι μέθοδοι που ταξινομούνται ως NGS απαιτούν ένα προηγούμενο στάδιο ενίσχυσης του DNA (δεν λειτουργούν με ένα μόνο μόριο). Επιπλέον, οι πλατφόρμες που χρησιμοποιούνται ποικίλλουν ευρέως. Οι αρχές των πιο δημοφιλών μεθόδων θα περιγραφούν παρακάτω:

Pyrosequencing

Περιλαμβάνει την παρακολούθηση της απελευθέρωσης πυροφωσφορικού, η οποία εμφανίζεται κάθε φορά που προστίθεται νέο νουκλεοτίδιο στον κλώνο DNA. Ένα σύστημα ενζύμου συνδέεται, έτσι ώστε η εκπομπή φωτός (η οποία είναι ανιχνεύσιμη από μία κάμερα) να συμβαίνει κάθε φορά που ενσωματώνεται ένα νέο νουκλεοτίδιο.

Η διαδικασία ξεκινά με τη ξεχωριστή επώαση κάθε αζωτούχου βάσης για να εξακριβωθεί εάν υπάρχει εκπομπή φωτός ή όχι. Το Pyrosequencing μπορεί να εκτελέσει την ανάγνωση των μακριών κλώνων, αλλά ο ρυθμός σφάλματος που διαπιστώθηκε είναι υψηλός.

Ακολουθία με σύνθεση

Αυτό περιλαμβάνει την ενσωμάτωση σημασμένων νουκλεοτιδίων. Αυτά τα φθορίζοντα συστατικά προστίθενται, πλένονται και το ενσωματωμένο νουκλεοτίδιο σημειώνεται. Στη συνέχεια, η σήμανση νουκλεοτιδίων απομακρύνεται και η σύνθεση του κλώνου μπορεί να συνεχιστεί. Στο επόμενο βήμα, θα ενσωματωθεί επίσης ένα επισημασμένο νουκλεοτίδιο και τα αναφερθέντα βήματα θα επαναληφθούν.

Ένα μειονέκτημα με αυτή την τεχνική συμβαίνει όταν οι φθορίζοντες δείκτες δεν εξαλείφονται πλήρως. Αυτές οι εκπομπές δημιουργούν σφάλματα υποβάθρου, με αποτέλεσμα σημαντικά λάθη.

Ακολουθία με σύνδεση

Αυτή η τεχνική διαφέρει από τις άλλες, αφού δεν χρησιμοποιεί ϋΝΑ πολυμεράση. Αντ 'αυτού, το βασικό ένζυμο για αυτή τη μεθοδολογία είναι η λιγάση. Εδώ χρησιμοποιούνται θραύσματα DNA επισημασμένα φθορίζοντα, δεσμεύονται από το ένζυμο και ανιχνεύονται.

Το μεγαλύτερο πρόβλημα με αυτή την τεχνική είναι το πολύ μικρό μήκος του θραύσματος που είναι ικανό να επεξεργαστεί.

Ion Sequencing Torrent

Αυτή η τεχνική βασίζεται στη μέτρηση του ιόντος Η⁺ που απελευθερώνεται κάθε φορά που ενσωματώνεται ένα νέο νουκλεοτίδιο. Η αρχή είναι αρκετά παρόμοια με την πυροσυσσωμάτωση, αλλά πολύ φθηνότερη.

Παραδείγματα

Η αλληλουχία του ανθρώπινου γονιδιώματος

Της αλληλουχίας του γονιδιώματος του ανθρώπου είναι ένα από τα πιο ελπιδοφόρα προκλήσεις της βιολογίας, καθώς είναι ένα από τα πιο διάσημα αντιπαλότητες στην ιστορία της επιστήμης. Στην πραγματικότητα, για τους επιστήμονες που εμπλέκονται στο έργο, η αλληλουχία του γονιδιώματος έγινε ένας ανταγωνισμός.

Το 1990 ξεκίνησε αυτό που ονομάστηκε "έργο ανθρώπινου γονιδιώματος", με επικεφαλής τον διάσημο επιστήμονα, τον νικητή του βραβείου Νόμπελ, Τζέιμς Γουότσον. Μετά από ένα χρόνο, το 1991, ο Venter αναλαμβάνει την πρόκληση να «χτυπάει» τον Watson και να αναλύσει την αλληλουχία του γονιδιώματος μπροστά του. Ωστόσο, το 1992, ο Watson αποχώρησε και η εντολή λήφθηκε από έναν άλλο ερευνητή.

Το 1995 ο Venter ανακοίνωσε την επιτυχία του στην πλήρη αλληλούχιση ενός βακτηριακού γονιδιώματος με την τυχαία μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας. Ομοίως, η αντίθετη ομάδα ανακοίνωσε ένα χρόνο αργότερα την αλληλουχία του γονιδιώματος ζύμης.

Το έτος 2000 ο αγώνας τερματίστηκε. Και οι δύο εταιρείες δημοσίευσαν τα προκαταρκτικά αποτελέσματα του πλήρους γονιδιώματος σε δύο από τα πιο αναγνωρισμένα επιστημονικά περιοδικά: Φύση και Επιστήμη.

Ωστόσο, οι επιστήμονες συνέχισαν να εργάζονται για τη βελτίωση των προτάσεων, και το 2006 οι αλληλουχίες ολοκληρώθηκαν ορισμένα ανθρώπινα χρωμοσώματα.

Σημασία και εφαρμογές

Η γνώση της τάξης των νουκλεοτιδίων ενός μορίου τόσο σημαντικού όσο το DNA είναι πολύτιμη για τους βιολόγους και τους συναφείς επαγγελματίες. Αυτή η αλυσίδα πολυνουκλεοτιδίων περιέχει όλες τις απαραίτητες πληροφορίες για την ανάπτυξη και τη συντήρηση όλων των μορφών ζωής.

Για τους λόγους αυτούς, η γνώση αυτής της αλληλουχίας είναι απαραίτητη για τη βιολογική έρευνα. Βασικά, η ανάλυση της αλληλουχίας μας επιτρέπει να μετρήσουμε μία από τις σημαντικότερες ιδιότητες των βιολογικών συστημάτων και να καθορίσουμε διαφορές μεταξύ τους.

Ο προσδιορισμός αλληλουχίας χρησιμοποιείται ευρέως από taxonomists και συστηματική και ορισμένες αλληλουχίες DNA που τα κριτήρια επιτρέπουν να συμπεράνει κατά πόσον ή όχι δύο οργανισμοί ανήκουν στο ίδιο είδος, εκτός του ότι είναι σε θέση να υποθέσει τις φυλογενετικές σχέσεις.

Επιπλέον, η αλληλούχιση του DNA έχει εφαρμογές στον τομέα της ιατρικής και της διάγνωσης. Για παράδειγμα, υπάρχουν οικονομικά και συστήματα προσβάσιμο με αλληλούχιση για να αξιολογήσει την τάση να αναπτύσσουν ορισμένες ασθένειες (όπως ο καρκίνος) χρησιμοποιώντας πολυμορφισμούς απλών νουκλεοτιδίων που ονομάζεται (PNS).

Ποινικές έρευνες και ιατροδικαστικές τύπου έχουν επίσης εμπλουτιστεί τεχνικές αλληλούχισης, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αξιόπιστες αποδείξεις της συμμετοχής ορισμένων μεμονωμένων σε ένα έγκλημα.

Αναφορές

1. Heather, J. Μ., & Chain, Β. (2016). Η αλληλουχία των αλληλουχιών: το ιστορικό της αλληλουχίας του DNA. Γονιδιωματική, 107(1), 1-8.
2. Koboldt, C. D. Steinberg, Κ Μ, Larson, D. Ε, Wilson, R. Κ, & Mardis, Ε R. (2013). Η επόμενη γενιά της επανάληψης της αλληλουχίας και η επίδρασή της στη γονιδιωματική. Cell, 155(1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Επιστημονικές αντιξοότητες. Από το Galileo έως το έργο του ανθρώπινου γονιδιώματος. Paraninfo Editorial.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, Α. R. (1977). Ο προσδιορισμός αλληλουχίας ϋΝΑ με αναστολείς τερματισμού της αλύσου. Πρακτικά της Εθνικής Ακαδημίας Επιστημών, 74(12), 5463-5467.
5. Schuster, S.C. (2007). Η αλληλουχία επόμενης γενιάς μεταμορφώνει τη σημερινή βιολογία. Μέθοδοι φύσης, 5(1), 16.
6. Xu, J. (Ed.). (2014). Σειρά επόμενης γενιάς. Caister Academic Press.