Χαρακτηριστικά πρωτεϊνάσης Κ, ενζυματική δραστηριότητα και εφαρμογές

Το πρωτεϊνάση Κ είναι ένα ένζυμο που ανήκει στην ομάδα των πρωτεασών σερίνης, δηλαδή, έχει στο ενεργό καταλυτικό κέντρο του ένα αμινοξύ σερίνη και έχει τη λειτουργία της θραύσης των πεπτιδικών δεσμών με υδρόλυση. Με τη σειρά του αυτό το ένζυμο ανήκει στην οικογένεια πρωτεϊνών σουμπτιλισινών (πεπτιδάση S8).

Πρωτεϊνάση Κ έχει ένα μοριακό βάρος (MW) 28,900 daltons και των απομονώθηκε για πρώτη φορά το 1974 στα εκχυλίσματα του μύκητα Engyodontium album, παλαιότερα γνωστό με το όνομα του Tritirachium album Limber.

Παρουσιάζει υψηλή πρωτεολυτική ικανότητα, αποδεδειγμένα ικανή να αποικοδομεί την κερατίνη που υπάρχει στα μαλλιά. Η λέξη κερατίνη στα αγγλικά γράφεται "κερατίνη", επομένως έχει ονομαστεί "πρωτεϊνάση Κ".

Λόγω της υψηλής ικανότητάς της να διασπά τις φυσικές πρωτεΐνες, αυτό το ένζυμο είναι χρήσιμο σε διάφορες τεχνικές μοριακής βιολογίας. Χρησιμοποιείται κυρίως για την απομόνωση και την παρασκευή νουκλεϊνικών οξέων με υψηλό μοριακό βάρος (MW).

Η πρωτεϊνάση Κ δρα μέσω της απελευθέρωσης του πυρηνικού DNA, ενώ καταστρέφει τις πρωτεΐνες και απενεργοποιεί τις RNases και DNases, δηλαδή εξαλείφει τις νουκλεάσες στα παρασκευάσματα DNA και RNA..

Από την άλλη πλευρά, έχει παρατηρηθεί ότι η πρωτεϊνάση Κ μπορεί να υδρολύσει μερικές μετουσιωμένες φυσικές πρωτεΐνες, γεγονός που έχει προκαλέσει το ενδιαφέρον των ερευνητών για τη χρήση τους στη μελέτη πρωτεϊνών πριονίων (PrPC).

Ωστόσο, παρά την υψηλή δραστικότητα του υφίστανται πρωτεολυτική πρωτεΐνες που είναι ανθεκτικά στη δράση της πρωτεϊνάσης Κ Μεταξύ αυτών, μερικοί ανώμαλων πρωτεϊνών ονομάζονται πρίον (ΡγΡ) που σχετίζεται με ΜΣΕ είναι.

Ευρετήριο

• 1 Χαρακτηριστικά της πρωτεϊνάσης Κ
• 2 Ενζυμική δραστηριότητα
• 3 Εφαρμογές
• 4 Πλεονεκτήματα της πρωτεϊνάσης Κ
• 5 Ανθεκτικές στις πρωτεϊνάσες πρωτεΐνες Κ
• 6 Αναφορές

Χαρακτηριστικά της πρωτεϊνάσης Κ

Η πρωτεϊνάση Κ έχει μια τριτοταγή δομή που σχηματίζεται από τρεις στρώσεις, με ένα φύλλο β των επτά αλυσίδων διασκορπισμένο μεταξύ δύο στρωμάτων ελίκων. Ανήκουν στην οικογένεια της πεπτιδάσης S8 χαρακτηρίζεται από δραστική θέση της σε μια καταλυτική τριάδα, των οποίων η διαδοχική σειρά είναι (Asp, His και Ser), η οποία τα διαφοροποιεί από άλλες οικογένειες πεπτιδάσης.

Αυτό το ένζυμο πρωτεασών σερίνης, η οποία χαρακτηρίζεται από υδρόλυση των πεπτιδικών δεσμών κοντά στο καρβοξυ ομάδα αλειφατικών και αρωματικών αμινοξέων.

Επιπλέον, είναι σε θέση να δράσει με την παρουσία ορισμένων διαβρωτικών, όπως δωδεκυλ θειικό νάτριο (SDS), Tris-HCL και EDTA, που χρησιμοποιούνται για να βοηθήσουν την μετουσίωση των πρωτεϊνών, προκαλώντας τους να χάσουν μητρική δομή ουσίες τους.

Αυτό είναι ένα προκαταρκτικό βήμα στην παρασκευή πρωτεϊνών για την τεχνική ηλεκτροφόρησης. Η περιοχή ρΗ στην οποία δρα η πρωτεϊνάση Κ είναι αρκετά ευρεία (2,0 έως 12,0), με ένα βέλτιστο ρΗ μεταξύ 7,5 και 12,0 και το ισοηλεκτρικό σημείο της είναι 8,9. Όπως μπορεί να παρατηρηθεί, είναι δραστικό ενάντια σε πολύ ευρύ φάσμα ρΗ.

Ένα άλλο χαρακτηριστικό που ξεχωρίζει στην πρωτεϊνάση Κ είναι η σταθερότητά της παρουσία υψηλών θερμοκρασιών (50 - 60 ° C).

Ενζυματική δραστηριότητα

Η πρωτεϊνάση Κ χρειάζεται την παρουσία ιόντων ασβεστίου, αν και αυτό δεν επηρεάζει τη δραστηριότητά της, εάν είναι απαραίτητο να διατηρηθεί η σταθερότητά της.

Για πέψη πρωτεϊνάσης Κ εκτελέσει πλήρεις υποστρώματος απαιτείται χρόνος επαφής περίπου από 5 λεπτά έως 2 ώρες.

Ωστόσο, σε αυτή την έννοια, ο Daza et al. Συγκρίθηκε με την καθαρότητα του ϋΝΑ που ελήφθη αρκετές φορές από την έκθεση σε πρωτεϊνάση Κ και κατέληξε στο συμπέρασμα ότι μια παρατεταμένη επώαση (έως 24 ώρες) βελτιώνει σημαντικά την ποιότητα του DNA.

Τώρα, σε σχέση με την συγκέντρωση που χρησιμοποιείται στο ένζυμο πρωτεϊνάση Κ στα διαφορετικά πρωτόκολλα, μπορεί να πει κανείς ότι είναι ποικίλη.

Μπορεί να χρησιμοποιηθεί από πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις (5 μg / ml) σε συγκεντρώσεις 500 μg / ml. Όμως, οι συχνότερες συγκεντρώσεις εργασίας κυμαίνονται μεταξύ 50-100 μg / ml, ειδικά για την πέψη πρωτεϊνών και την απενεργοποίηση της νουκλεάσης. Παρόλο που απαιτείται συγκέντρωση 2 mg / ml για τη θεραπεία του ιστού.

Εφαρμογές

Οι εφαρμογές της είναι πολύ ευρείες και μπορούν να συνοψιστούν στα εξής:

-Χρησιμοποιείται στην πέψη των πρωτεϊνών και των μεθόδων εκχύλισης DNA όπως είναι διάφορες: εξαλάτωση, ΡΚ-SDS, βρωμιούχο κετυλοτριμεθυλαμμώνιο αμμώνιο βρωμίδιο (CTAB), και οξικού καλίου τροποποιημένο εκχύλιση με ιωδιούχο νάτριο.

-Απενεργοποίηση των νουκλεασών (RNases και DNases).

-Στην τεχνική υβριδοποίησης επί τόπου (HIS), για να βοηθήσουν στην απελευθέρωση του νουκλεϊκού οξέος, εκτός από την εξάλειψη ανεπιθύμητων πρωτεϊνών.

-Τροποποίηση πρωτεΐνης.

-Στο ερευνητικό επίπεδο, σε διάφορες μελέτες.

Πλεονεκτήματα της πρωτεϊνάσης Κ

Υπήρξαν αρκετές μελέτες που συνέκριναν τεχνικές εκχύλισης DNA χρησιμοποιώντας Πρωτεϊνάση Κ, με τους άλλους που δεν έχουν χρησιμοποιηθεί και όλα καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι υπάρχει μεγαλύτερη όταν χρησιμοποιείται το ένζυμο. Μεταξύ των πλεονεκτημάτων, μπορούν να αναφερθούν τα εξής:

-Υψηλού μοριακού βάρους DNA υψηλής ποιότητας και καθαρότητας λαμβάνεται.

-Το εξαγόμενο DNA είναι σταθερό έως και 3 μήνες.

Το εκχυλισμένο DNA μπορεί να χρησιμοποιηθούν στις ακόλουθες τεχνικές: στυπώματος Southern, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), ηλεκτροφόρηση, μεταξύ άλλων.

Πρωτεΐνες ανθεκτικές στην πρωτεϊνάση Κ

Η έρευνα έχει καταλήξει στο συμπέρασμα ότι οι prions (PrPSc τοξικές ανώμαλων πρωτεϊνών) διαφοροποιείται από PrPC πρωτεΐνες (μητρική) να είναι ανθεκτικά στη δράση της πρωτεϊνάσης Κ, ενώ PrPC είναι ευαίσθητα στη δράση.

Άλλοι συγγραφείς έχουν περιγράψει ότι στη δομή του PrPSc υπάρχουν ευαίσθητα τμήματα και άλλα ανθεκτικά πρωτεϊνάση Κ Ωστόσο, και οι δύο πλευρές είναι εξίσου τοξικά και μολυσματικούς.

Από την άλλη πλευρά, ο Bastian και οι συνεργάτες του το 1987 απομόνωσαν 4 πρωτεΐνες των 28, 30, 66 και 76 kda από ένα είδος Spiroplasma mirum. Όλοι ήταν ανθεκτικοί στη δράση της πρωτεϊνάσης Κ και είχαν επίσης διασταυρούμενη αντίδραση με μερικά πριόνια.

Είναι γνωστό ότι το είδος αυτό μπορεί να προκαλέσει καταρράκτη και σημαντικές νευρολογικές βλάβες και λόγω επιστημονικά ευρήματα Bastian, μεταξύ άλλων, την έρευνα, έχει προσπαθήσει να συνδεθεί με αυτό το μικροοργανισμό με τις μεταδοτικές σπογγώδεις εγκεφαλοπάθειες.

Ωστόσο, η αιτιολογία αυτής της εκφυλιστικής νευρολογικής παθολογίας εξακολουθεί να αποδίδεται στα πριόνια σήμερα.

Υπό αυτή την έννοια, ο Μπάτλερ και οι συνεργάτες του το 1991 αναγνώρισαν και χαρακτήρισαν μια κατηγορία πρωτεΐνης Κ πρωτεϊνάσης 40 Kda από δύο στελέχη Mycoplasma hyorhinis. Αυτό το παθογόνο επηρεάζει τους χοίρους, μολύνοντας τους ιστούς τους, αλλά στην περίπτωση αυτή δεν υπήρξε διασταυρούμενη αντίδραση με τα δοκιμασμένα πριόνια.

Απαιτούνται περισσότερες έρευνες για να διασαφηνιστούν πολλά άγνωστα γι 'αυτό.

Αναφορές

1. Bastian ινιδίων F, Jennings R, και Gardner W. 1987. Ο αντιορός στην τρομώδη νόσο σχετιζόμενη πρωτεΐνη διαντιδρά με Spiroplasma mirum ινιδίων. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Αξιολόγηση μεθόδου εκχύλισης και καθαρισμού DNA από μυϊκό ιστό σταθεροποιημένο σε φορμαλδεΰδη από άγνωστα πτώματα.  Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani Η, Κονγκ L, Μ Frick, Evancho S, Stanbridge Ε, Και McGarrity G. Ταυτοποίηση και Χαρακτηρισμός των ανθεκτικών στην πρωτεϊνάση Κ Πρωτεΐνες σε μέλη της κατηγορίας Mollicutes. Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López Μ, Rivera Μ, Viettri Μ, Lares Μ, Morocoima Α, Herrera L, et αϊ. Σύγκριση δύο πρωτοκόλλων για την εξαγωγή DNA από Trypanosoma cruzi που καλλιεργούνται σε ασενικό μέσο. Αναθ. Περού. Μεσογειακή Δημοτική Υγεία  2014; 31 (2): 222-227. Διατίθεται στο: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos Μ, Jiménez Ε και Palma W. Προσδιορισμός της αποτελεσματικότητας πέντε πρωτόκολλων εκχύλισης DNA από υλικό παραφίνης για μοριακές μελέτες. Rev Méd Univ Κόστα Ρίκα. 2007; 1 (1): 10-19.