DNA microarrays σε αυτό που αποτελείται, διαδικασία και εφαρμογές

Α Μικροδιάταξη DNA, Ονομάζεται επίσης τσιπ DNA ή μικροσυστοιχία DNA, αποτελείται από μια σειρά θραυσμάτων DNA αγκιστρωμένα σε μια φυσική υποστήριξη από μεταβλητό υλικό, είτε από πλαστικό είτε από γυαλί. Κάθε κομμάτι DNA αντιπροσωπεύει αλληλουχία συμπληρωματική προς ένα συγκεκριμένο γονίδιο.

Ο κύριος στόχος των microarrays είναι η συγκριτική μελέτη της έκφρασης ορισμένων γονιδίων ενδιαφέροντος. Για παράδειγμα, είναι συνηθισμένο ότι αυτή η τεχνική εφαρμόζεται σε δύο δείγματα - μία υπό υγιείς συνθήκες και μία παθολογική - προκειμένου να προσδιοριστούν τα γονίδια που εκφράζονται και τα οποία δεν βρίσκονται στο δείγμα που παρουσιάζει την κατάσταση. Το εν λόγω δείγμα μπορεί να είναι κύτταρο ή ιστός.

Γενικά η έκφραση των γονιδίων μπορεί να ανιχνευθεί και να ποσοτικοποιηθεί χάρη στη χρήση φθοριζόντων μορίων. Ο χειρισμός των τσιπ πραγματοποιείται στις περισσότερες περιπτώσεις από ρομπότ και ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων μπορεί να αναλυθεί ταυτόχρονα.

Αυτή η καινοτόμος τεχνολογία είναι χρήσιμη για ένα ευρύ φάσμα επιστημονικών κλάδων, από την ιατρική διάγνωση έως τις διάφορες μελέτες μοριακής βιολογίας στους τομείς της πρωτεϊνωματικής και της γονιδιωματικής.

Ευρετήριο

• 1 Από τι συνίσταται;?
  • 1.1 Τύποι μικροσυστοιχιών
• 2 Διαδικασία
  • 2.1 Απομόνωση RNA
  • 2.2 Παραγωγή και επισήμανση του cDNA
  • 2.3 Υβριδισμός
  • 2.4 Ανάγνωση συστήματος
• 3 Εφαρμογές
  • 3.1 Καρκίνος
  • 3.2 Άλλες ασθένειες
• 4 Αναφορές

Από τι συνίσταται;?

Οι μικροσυστοιχίες DNA (δεοξυριβονουκλεϊνικό οξύ) είναι ένα σύνολο ειδικών τμημάτων ϋΝΑ προσαρτημένων σε μια στερεή μήτρα. Αυτές οι αλληλουχίες είναι συμπληρωματικές των γονιδίων που επιθυμούν να μελετηθούν και μπορεί να υπάρχουν έως και 10.000 γονίδια ανά cm².

Αυτά τα χαρακτηριστικά επιτρέπουν τη συστηματική και μαζική μελέτη της γονιδιακής έκφρασης ενός οργανισμού.

Οι πληροφορίες που χρειάζεται ένα κύτταρο για τη λειτουργία του κωδικοποιούνται σε μονάδες που ονομάζονται "γονίδια". Ορισμένα γονίδια περιέχουν οδηγίες για τη δημιουργία βασικών βιολογικών μορίων που ονομάζονται πρωτεΐνες.

Ένα γονίδιο εκφράζεται αν το DNA του μεταγραφεί σε ένα ενδιάμεσο μόριο αγγελιαφόρου RNA και η έκφραση του γονιδίου μπορεί να ποικίλει ανάλογα με το επίπεδο μεταγραφής αυτού του τμήματος DNA. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η αλλαγή στην έκφραση μπορεί να είναι ενδεικτική των ασθενειών.

Η αρχή της υβριδοποίησης καθιστά δυνατή τη λειτουργία των microarrays. Το DNA είναι ένα μόριο που αποτελείται από τέσσερις τύπους νουκλεοτιδίων: αδενίνη, θυμίνη, γουανίνη και κυτοσίνη.

Για να σχηματιστεί η διπλή ελικοειδής δομή, η αδενίνη ομαδοποιείται με θυμίνη και κυτοσίνη με γουανίνη. Έτσι, δύο συμπληρωματικές αλυσίδες μπορούν να συνδεθούν με δεσμούς υδρογόνου.

Τύποι microarrays

Όσον αφορά τη δομή της μικροσυστοιχίες υπάρχουν δύο παραλλαγές: οι κατά παραγγελία συμπληρωματικό DNA ή μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων και εμπορικές υψηλής πυκνότητας γίνονται από εμπορικές εταιρείες όπως η Affymetrix GeneChip.

Ο πρώτος τύπος της μικροσυστοιχίας επιτρέπει την ανάλυση του RNA από δύο διαφορετικά δείγματα σε ένα μόνο τσιπ, ενώ η δεύτερη παραλλαγή είναι του εμπορικού τύπου και έχει ένα μεγάλο αριθμό γονιδίων (για παράδειγμα ο Affymetrix GeneChip έχει περίπου 12.000 ανθρώπινα γονίδια) που επιτρέπουν την ανάλυση ένα μόνο δείγμα.

Διαδικασία

Απομόνωση RNA

Το πρώτο βήμα για να εκτελεστεί ένα πείραμα χρησιμοποιώντας τεχνολογία microarray είναι η απομόνωση και ο καθαρισμός μορίων RNA (μπορεί να είναι αγγελιοφόρος RNA ή άλλοι τύποι RNA).

Εάν θέλετε να συγκρίνετε δύο δείγματα (υγιή έναντι ασθενών, έλεγχος έναντι θεραπείας, μεταξύ άλλων) η απομόνωση του μορίου και στους δύο ιστούς πρέπει να γίνει.

Παραγωγή και επισήμανση του cDNA

Ακολούθως, το RNA υποβάλλεται σε μία διαδικασία ανάστροφης μεταγραφής παρουσία σηματοδοτημένων νουκλεοτιδίων και έτσι το συμπληρωματικό ϋΝΑ ή cDNA θα ληφθεί..

Η ετικέτα μπορεί να είναι φθορίζουσα και πρέπει να είναι διαφοροποιήσιμη μεταξύ των δύο ιστών που πρόκειται να αναλυθούν. Οι φθορίζουσες ενώσεις Cy3 και Cy5 χρησιμοποιούνται παραδοσιακά, δεδομένου ότι εκπέμπουν φθορισμό σε διαφορετικά μήκη κύματος. Στην περίπτωση Cy3 είναι ένα χρώμα κοντά στο κόκκινο και Cy5 αντιστοιχεί στο φάσμα μεταξύ πορτοκαλί και κίτρινο.

Υβριδισμός

Τα cDNAs αναμιγνύονται και οι τομές επωάστηκαν στην μικροσυστοιχία DNA για να επιτραπεί υβριδοποίηση (δηλ, συμβαίνει σύνδεση) cDNA από αμφότερα τα δείγματα με το τμήμα DNA ακινητοποιημένο επί της στερεάς επιφανείας της μικροσυστοιχίας.

Ένα υψηλότερο ποσοστό υβριδισμού με τον ανιχνευτή στην μικροσυστοιχία ερμηνεύεται ως μεγαλύτερη έκφραση ιστού του αντίστοιχου mRNA.

Αναγνώριση συστήματος

Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης γίνεται με την ενσωμάτωση ενός συστήματος ανάγνωσης που αποδίδει έναν κώδικα χρώματος στην ποσότητα φθορισμού που εκπέμπεται από κάθε cDNA. Για παράδειγμα, εάν χρησιμοποιείται κόκκινο για να σηματοδοτήσει την παθολογική κατάσταση και υβριδοποιείται σε μεγαλύτερη αναλογία, το κόκκινο συστατικό θα είναι το κυρίαρχο.

Με αυτό το σύστημα είναι δυνατόν να γνωρίζουμε την υπερέκφραση ή την καταστολή κάθε γονιδίου που αναλύεται και στις δύο επιλεγμένες συνθήκες. Με άλλα λόγια, μπορείτε να γνωρίζετε το transcriptome των δειγμάτων που αξιολογήθηκαν στο πείραμα.

Εφαρμογές

Επί του παρόντος, οι μικροσυστοιχίες θεωρούνται πολύ ισχυρά εργαλεία στον τομέα της ιατρικής. Αυτή η νέα τεχνολογία επιτρέπει τη διάγνωση ασθενειών και την καλύτερη κατανόηση του τρόπου με τον οποίο η γονιδιακή έκφραση τροποποιείται υπό διαφορετικές ιατρικές συνθήκες.

Επιπροσθέτως, επιτρέπει τη σύγκριση ιστού ελέγχου και ιστού που υποβλήθηκε σε θεραπεία με ένα συγκεκριμένο φάρμακο, προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση μιας πιθανής ιατρικής θεραπείας.

Για να γίνει αυτό, η κανονική κατάσταση και η νοσηρή κατάσταση συγκρίνονται πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμάκου. Κατά τη μελέτη της επίδρασης του φαρμάκου στο γονιδίωμα in νίνο έχετε μια καλύτερη εικόνα του μηχανισμού δράσης του. Επιπλέον, μπορεί να γίνει κατανοητό γιατί ορισμένα συγκεκριμένα φάρμακα οδηγούν σε ανεπιθύμητες παρενέργειες.

Καρκίνος

Ο καρκίνος επικαλύπτει τους καταλόγους ασθενειών που μελετήθηκαν με μικροσυστοιχίες DNA. Αυτή η μεθοδολογία έχει χρησιμοποιηθεί για την ταξινόμηση και πρόγνωση της νόσου, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις λευχαιμίας.

Το πεδίο της έρευνας αυτής της κατάστασης περιλαμβάνει συμπίεση και χαρακτηρισμός της μοριακής βάσης των καρκινικών κυττάρων για να βρείτε πρότυπα γονιδιακής έκφρασης που οδηγούν σε αποτυχίες στη ρύθμιση διεργασιών κυτταρικού θανάτου (ή απόπτωση) του κυτταρικού κύκλου και.

Άλλες ασθένειες

Με τη χρήση μικροσυστοιχιών έχουν αποκαλυφθεί τα προφίλ διαφορική έκφραση των γονιδίων σε ιατρικές καταστάσεις των αλλεργιών, πρωτοπαθείς ανοσοανεπάρκειες, αυτοάνοσες ασθένειες (όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα) και λοιμωδών νόσων.

Αναφορές

1. Bednar, Μ. (2000). Τεχνολογία DNA microarray και εφαρμογή. Ιατρική Επιστήμη Monitor, 6(4), ΜΤ796-ΜΤ800.
2. Kurella, Μ., Hsiao, L., Yoshida, Τ., Randall, J.D., Chow, G., Sarang, S., & Gullans, S.R. (2001). Ανάλυση μικροσυστοιχιών DNA σύνθετων βιολογικών διεργασιών. Εφημερίδα της Αμερικανικής Εταιρείας Νεφρολογίας, 12(5), 1072-1078.
3. Nguyen, D.V., Bulak Arpat, Α., Wang, Ν., & Carroll, R.J. (2002). Πειράματα μικροσυστοιχίας DNA: βιολογικές και τεχνολογικές πτυχές. Βιομετρία, 58(4), 701-717.
4. Plous, C.V. (2007). DNA microarrays και οι εφαρμογές τους στη βιοϊατρική έρευνα. CENIC Magazine. Βιολογικές επιστήμες, 38(2), 132-135.
5. Wiltgen, Μ., & Tilz, G.P. (2007). Ανάλυση μικροσυστοιχιών DNA: αρχές και κλινικές επιπτώσεις. Αιματολογία, 12(4), 271-287.