Χαρακτηριστικά βακτηριακού επιχρίσματος και προετοιμασία

Το βακτηριακό επίχρισμα είναι μια επέκταση με τη μορφή λεπτού φιλμ ενός εναιωρήματος βακτηριακών μικροοργανισμών που διεξάγεται σε διαφανή γυάλινη πλάκα ή αντικειμενοφόρους πλάκες για παρατήρηση υπό οπτικό μικροσκόπιο.

Η επέκταση σε μορφή μεμβράνης πραγματοποιείται προκειμένου να διαχωριστούν οι μικροοργανισμοί όσο το δυνατόν περισσότερο, διότι αν ομαδοποιηθούν, η παρατήρηση δεν είναι σαφής.

Στη μελέτη των βακτηριακών καλλιεργειών χρησιμοποιούνται τεχνικές για την προετοιμασία των επιχρισμάτων, τη σταθεροποίηση και τον χρωματισμό για την καλύτερη ανάλυση τους. Λόγω του μικρού μεγέθους των μικροοργανισμών, απαιτείται η χρήση οπτικού μικροσκοπίου για την παρατήρησή του.

Τα οπτικά μικροσκόπια είναι απαραίτητα όργανα για την παρατήρηση των επιχρισμάτων. Αυτοί χρησιμοποιούν οπτικούς φακούς και φως που επιτρέπει την απεικόνιση των δειγμάτων με μεγάλη αύξηση του μεγέθους.

Γενικά, τα ζωντανά κύτταρα δεν έχουν δομές που είναι ως επί το πλείστον χρωματισμένες, βλέποντας μέσω του οπτικού μικροσκοπίου είναι άχρωμα, διαφανή δείγματα και παρουσιάζουν πολύ μικρή εσωτερική αντίθεση και με το περιβάλλον τους.

Η παρατήρηση με το απλό μικροσκόπιο φωτός πεδίου, χωρίς τη χρήση βοηθητικών τεχνικών χρώσης, είναι πολύ περιορισμένη και χρησιμοποιείται μόνο σε ορισμένες περιπτώσεις, όπως στην παρατήρηση της κίνησης των μικροοργανισμών.

Για την άριστη παρακολούθηση των μικροοργανισμών, πρέπει να επιτευχθεί ισορροπία μεταξύ αντίθεσης και ανάλυσης. Οι λεπτομέρειες των κυττάρων δεν μπορούν να παρατηρηθούν υπό μικροσκόπιο, ακόμη και σε υψηλή ανάλυση. η χρήση βαφών απαιτείται μέσω τεχνικών χρώσης, οι οποίες παρέχουν αντίθεση για παρατήρηση.

Ευρετήριο

• 1 Χαρακτηριστικά ενός βακτηριακού επιχρίσματος καλής ποιότητας
  • 1.1 Εξαιρετική αντίθεση
  • 1.2 Καλή επίλυση
  • 1.3 Καλή χρώση
• 2 Προετοιμασία
  • 2.1 Α. Frotis
  • 2.2 Β. Στερέωση
  • 2.3 Γ. Απλή χρώση
  • 2.4 Δ. Οριστική διατήρηση του επιχρίσματος
• 3 Αναφορές

Χαρακτηριστικά ενός βακτηριακού επιχρίσματος καλής ποιότητας

Εξαιρετική αντίθεση

Για να επιτευχθεί μια εξαιρετική αντίθεση υπάρχουν λεγόμενα πολύπλοκα μικροσκόπια μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης, διαφορική παρεμβολή και μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου. Αυτός ο τύπος μικροσκοπίου χρησιμοποιείται για την παρατήρηση βακτηριακών δομών, όπως θηκών και νηματίων, μεταξύ άλλων.

Η χρώση είναι μια απλή τεχνική για την αύξηση της αντίθεσης που επιτυγχάνεται με ένα μικροσκόπιο με καθαρό πεδίο. Στην τεχνική αυτή, μπορούν να χρησιμοποιηθούν διαφορετικές βαφές που βελτιώνουν αισθητά την παρατήρηση κάτω από το μικροσκόπιο.

Οι λεκέδες γίνονται απ 'ευθείας επί των επιχρισμάτων ή των επεκτάσεων των εναιωρημάτων μικροοργανισμών στις αντικειμενοφόρες πλάκες, που έχουν προηγουμένως ξηρανθεί και σταθεροποιηθεί.

Καλά διορθώστε

Η σταθεροποίηση είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για τη διατήρηση κυτταρικών δομών. προκαλεί απενεργοποίηση των μικροοργανισμών και προσκόλληση στο γυαλί της ολίσθησης. Υπάρχουν διάφορες θεραπείες στερέωσης: σταθεροποίηση θερμότητας και χημική σταθεροποίηση.

Στερέωση θερμότητας

Αυτή είναι η μέθοδος που χρησιμοποιείται περισσότερο στην παρατήρηση βακτηριακού επιχρίσματος. Η τεχνική συνίσταται στη διέλευση του βακτηριακού εναιωρήματος του επιχρίσματος από τη φλόγα ενός αναπτήρα. Αυτή η τεχνική είναι σε θέση να διατηρήσει την εξωτερική μορφολογία των βακτηρίων, αλλά καταστρέφει τις εσωτερικές τους δομές.

Χημική σταθεροποίηση

Η χημική σταθεροποίηση χρησιμοποιεί χημικές ουσίες σε συντήρηση, όπως φορμαλδεΰδη ή φορμαλδεΰδη, αιθανόλη και οξικό οξύ, μεταξύ άλλων. Το πλεονέκτημα της χρήσης χημικών παραγόντων στερέωσης είναι ότι επιτυγχάνεται η διατήρηση των εσωτερικών κυτταρικών δομών των μικροοργανισμών.

Καλή χρώση

Οι πιο κοινές διαδικασίες για τη χρώση ενός προηγουμένως αποξηραμένου και σταθερού επιχρίσματος είναι θετικές ή απλές χρώσεις, διαφορική χρώση και αρνητική χρώση. Υπάρχουν επίσης ειδικές τεχνικές για τη χρώση συγκεκριμένων κυτταρικών δομών (κάψουλα, σπόρια, μαστίγια).

Θετική χρώση ή απλή χρώση

Θετική ή απλή χρώση είναι η πιο χρησιμοποιούμενη τεχνική λεκέ χρώματος. Χρησιμοποιεί χρωστικές ουσίες που έχουν την ικανότητα να δεσμεύονται με συγκεκριμένες μικροβιακές δομές, επιτρέποντάς τους να παρατηρούνται κάτω από μικροσκόπιο.

Αυτές οι χρωστικές έχουν χρωμοφόρες ομάδες (έγχρωμο τμήμα) στη χημική τους δομή, με εναλλασσόμενους διπλούς δεσμούς και απλούς δεσμούς (σύζευξη). Αυτοί οι δεσμοί μπορούν με τη σειρά τους να δημιουργήσουν ιοντικούς ή ομοιοπολικούς δεσμούς με ορισμένες κυτταρικές δομές.

Οι χρωστικές που χρησιμοποιούνται σε θετική ή απλή χρώση είναι κυρίως χημικά παράγωγα του ανιλίνη (έγχρωμα οργανικά άλατα).

Από την άλλη πλευρά, μεταξύ των χρωστικών μπορούμε να βρούμε μερικά βασικά pH και άλλα με οξύ pH.

Βασικά χρώματα

Στις βασικές βαφές, η ομάδα χρωμοφόρου έχει ένα θετικό ηλεκτρικό φορτίο. Η μεγάλη πλειοψηφία των προκαρυωτικών μικροοργανισμών έχει ένα ουδέτερο εσωτερικό ρΗ και η κυτταρική τους επιφάνεια είναι αρνητικά φορτισμένη. Μέσω αυτής της ηλεκτροστατικής αλληλεπίδρασης, το χρωμοφόρο δεσμεύει το κύτταρο και τις χρωστικές.

Παραδείγματα βασικών βαφών είναι το κυανό του μεθυλενίου, ο ιώδης κρύσταλλος, το πράσινο μαλαχίτη, η βασική φουκκίνη, η σαφρανίνη, μεταξύ άλλων.

Οξικές βαφές

Σε όξινες βαφές η χρωμοφόρος ομάδα έχει αρνητικό ηλεκτρικό φορτίο. Αυτά χρησιμοποιούνται για τη χρώση πρωτεϊνών με θετικά φορτισμένες αμινομάδες. Παραδείγματα όξινων βαφών είναι η όξινη φουκκίνη, το τριαντάφυλλο της Βεγγάλης, το κόκκινο του Κονγκό και η ηωσίνη.

Διαφορική χρώση

Η τεχνική της διαφορικής χρώσης συνίσταται στην εφαρμογή δύο βαφών διαφορετικού χρώματος ή έντασης, για να διακρίνουμε διαφορετικούς μικροοργανισμούς κάτω από το μικροσκόπιο. Η χρώση με Gram και η χρώση με αντίσταση σε όξινο αλκοόλ είναι οι πιο διαδεδομένες διαφορικές κηλίδες στη βακτηριολογία.

Η χρώση Gram χρησιμοποιείται ως προκαταρκτική δοκιμή για να γνωρίζει το σχήμα, το μέγεθος, την κυτταρική ομαδοποίηση, εκτός από τον τύπο του κυτταρικού τοιχώματος. Μέσω της δοκιμής χρώσης Gram, βακτήρια με κυτταρικό τοίχωμα ταξινομούνται ως θετικά κατά Gram βακτήρια και Gram-αρνητικά βακτηρίδια.

Αρνητική χρώση

Στην τεχνική αυτή χρησιμοποιούνται χημικές χρωστικές ουσίες που δεν διεισδύουν στο κυψελοειδές εσωτερικό, αλλά κάνουν ότι το μέσο στο οποίο εμφανίζονται οι μικροοργανισμοί ως ένα μαύρο φόντο.

Στην τεχνική της αρνητικής χρώσης, το επίχρισμα γίνεται με μια σταγόνα εναιωρήματος κινέζικου μελανιού ή νιτροσίνης, η οποία αφού αφήνει την ξήρανση σε θερμοκρασία δωματίου σχηματίζει ένα αδιαφανές φιλμ στη διέλευση του φωτός. Με αυτόν τον τρόπο, οι μικροοργανισμοί παρατηρούνται ως φωτεινές μορφές σε σκούρο φόντο.

Προετοιμασία

Α. Σμέαρ

1.- Πλένετε τις αντικειμενοφόρες πλάκες πολύ καλά, στεγνώνετε με απορροφητικό χαρτί και τις επισημαίνετε. Η ετικέτα πρέπει να αναφέρει το περιεχόμενο του παρασκευάσματος, την ημερομηνία και το όνομα του προσώπου που το επεξεργάστηκε.

2.- Φωτίστε τον αναπτήρα και αποστειρώστε τον βρόχο εμβολιασμού στη φλόγα μέχρι να ζεσταθεί.

3.- Αφήστε τη λαβή να κρυώσει.

4.- Πάρτε τον σωλήνα της βακτηριακής καλλιέργειας, αφαιρέστε το καπάκι και περάστε γρήγορα το στόμιο του σωλήνα κοντά στη φλόγα του αναπτήρα (φλόγα).

5.- Εισάγετε τον βρόχο εμβολιασμού μέσα στον σωλήνα που περιέχει την βακτηριακή καλλιέργεια και πάρτε το δείγμα.

6.- Εάν η καλλιέργεια είναι σε υγρό μέσο, ​​τοποθετήστε το δείγμα που ελήφθη με τη λαβή στο κέντρο της ολίσθησης και απλώστε το προσεκτικά σε κύκλο διαμέτρου περίπου 2 cm.

7.- Αποστείλετε εκ νέου τον βρόχο εμβολιασμού.

8.- Αφήστε να στεγνώσει το επίχρισμα στον αέρα.

9.- Επαναλάβετε τα βήματα 3 έως 8 τρεις φορές.

10.- Εάν η καλλιέργεια είναι σε στερεό μέσο, ​​μια σταγόνα αποσταγμένου νερού θα πρέπει προηγουμένως να τοποθετηθεί στην ολίσθηση. Αυτό γίνεται για να αναμιχθεί ένα μικρό δείγμα της καλλιέργειας που ελήφθη με τη λαβή του εμβολιασμού, σύμφωνα με τις ενδείξεις των σταδίων 2 έως 5 (συνθήκες ασηψίας).

11.- Επεκτείνετε το αραιωμένο δείγμα με τη σταγόνα νερού στη διαφάνεια και επαναλάβετε τρεις φορές.

Β. Σταθεροποίηση

1.- Προσθέστε στα ξηρά επιχρίσματα - που παράγονται από καλλιέργειες σε υγρό μέσο - δύο σταγόνες μεθανόλης ή απόλυτης αιθανόλης.

2.- Αφήστε να στεγνώσει στον αέρα μακριά από τον αναπτήρα.

3.- Εάν το επίχρισμα προέρχεται από μια καλλιέργεια σε στερεό μέσο, ​​το ξηρό επίχρισμα σταθεροποιείται με θερμότητα, περνώντας το 2 με 3 φορές γρήγορα μέσα από το καυτό σημείο της φλόγας του αναπτήρα.

4.- Αγγίξτε το κάτω μέρος του επιθέματος με το ραχιαίο τμήμα του αριστερού χεριού (για δεξιό χέρι, διαφορετικά χρησιμοποιήστε το δεξί χέρι) και ελέγξτε ότι είναι κρύο.

Γ. Απλή χρώση

1.- Προσθέστε 2 σταγόνες της επιλεγμένης χρωστικής στο επίχρισμα και αφήστε το να δράσει για το χρόνο που απαιτείται στα συγκεκριμένα πρωτόκολλα κάθε χρωστικής ουσίας (συνήθως μεταξύ 1 και 5 λεπτών).

2.- Ορισμένες βαφές απαιτούν τη χρήση θερμότητας για την ενεργοποίησή τους, οπότε είναι απαραίτητο να είστε πολύ προσεκτικοί κατά τη θέρμανση της ολίσθησης στη φλόγα του αναπτήρα (χειριστείτε με τσιμπιδάκια και αποφύγετε το βρασμό). Η υπερθέρμανση του επιθέματος μπορεί να καταστρέψει τα κύτταρα που θέλετε να παρατηρήσετε.

3.- Αφαιρέστε την περίσσεια της βαφής πλένοντας με απεσταγμένο νερό από μια εικονογραφία. Αφαιρέστε το νερό του πλυσίματος αγγίζοντας απαλά την ολίσθηση στην άκρη του, γυρισμένη στην τραπέζι εργασίας.

4.- Αφήστε να στεγνώσει ο αέρας.

5.- Ανάλογα με τον τύπο της παρατήρησης, χρησιμοποιείται ένα κάλυμμα ή όχι σε αυτό το στάδιο. Το κάλυμμα προστατεύει και διατηρεί το επίχρισμα. Εάν παρατηρηθεί παρατήρηση με βύθιση σε λάδι σε αυτό το στάδιο, δεν χρησιμοποιείται καλυπτρίδα αλλά το επίχρισμα δεν μπορεί να διατηρηθεί.

Δ. Οριστική διατήρηση του επιχρίσματος

1.- Βυθίστε το επίθεμα διαδοχικά σε καθένα από τα διαλύματα που αναφέρονται παρακάτω, για τουλάχιστον 5 λεπτά. Ο σκοπός αυτών των "λουτρών" είναι να αφήσουν το επίχρισμα εντελώς αφυδατωμένο. Κάθε αντιδραστήριο πρέπει να αποστραγγιστεί πριν εισαχθεί το επίθεμα στο επόμενο λουτρό.

Η σειρά των λουτρών αφυδάτωσης έχει ως εξής:

1. Αιθανόλη 70%
2. 95% αιθανόλη
3. Καθαρή ακετόνη
4. Ανάμιξη ακετόνης-ξυλόλης 1: 1
5. Xilol

Στη συνέχεια, αφήστε τον αέρα να στεγνώσει.

2.- Τοποθετήστε το κάλυμμα, κατά προτίμηση 22 × 22 mm, χρησιμοποιώντας καναδικό βάλσαμο ή άλλα μέσα συναρμολόγησης.

Αναφορές

1. Briggs, G. (1965). Αιτιώδεις παράγοντες σε μικροβιολογικά εργαστηριακά ατυχήματα και λοιμώξεις. Βιολογικά εργαστήρια στρατού των ΗΠΑ. Fort Detrick.
2. Cappucino, J.G. και Welch, C.T. (2017). Μικροβιολογία: Ένα Εργαστηριακό Εγχειρίδιο. Pearson.
3. Holt, J.G. Editor (1977). Το συντομότερο εγχειρίδιο Bergey's Determininal Bacteriology. 8^th Βαλτιμόρη: Οι Williams και Wilkins Co.
4. Johnson, T.R. και υπόθεση. C.L. (2018). Εργαστηριακά πειράματα στη μικροβιολογία. Pearson.
5. Tille, Ρ. (2017). Διαγνωστική Μικροβιολογία. 14^th St. Louis, USA: Elsiever, Inc..