Λειτουργίες ενζύμων περιορισμού, μηχανισμός δράσης, τύποι και παραδείγματα

Το ένζυμα περιορισμού είναι ενδονουκλεάσες που χρησιμοποιούνται από ορισμένες αρχαιότητες και βακτήρια για να εμποδίσουν ή να «περιορίσουν» την εξάπλωση των ιών μέσα σε αυτά. Είναι ιδιαίτερα συχνές στα βακτήρια και αποτελούν μέρος του αμυντικού τους συστήματος έναντι ξένου DNA γνωστού ως σύστημα περιορισμού / τροποποίησης.

Αυτά τα ένζυμα καταλύουν την κοπή του δίκλωνου DNA σε συγκεκριμένες θέσεις, αναπαραγώγιμα και χωρίς τη χρήση πρόσθετης ενέργειας. Οι περισσότεροι απαιτούν την παρουσία συνπαραγόντων όπως το μαγνήσιο ή άλλα δισθενή κατιόντα, αν και μερικά απαιτούν επίσης την ΑΤΡ ή την S-αδενοσυλ μεθειονίνη.

Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού ανακαλύφθηκαν το 1978 από τους Daniel Nathans, Arber Werner και Hamilton Smith, οι οποίοι έλαβαν το βραβείο Νόμπελ Ιατρικής για την ανακάλυψή τους. Το όνομά του προέρχεται συνήθως από τον οργανισμό όπου παρατηρούνται για πρώτη φορά.

Τέτοια ένζυμα χρησιμοποιούνται ευρέως στην ανάπτυξη μεθόδων κλωνοποίησης DNA και άλλων στρατηγικών μοριακής βιολογίας και γενετικής μηχανικής. Τα χαρακτηριστικά της αναγνώρισης συγκεκριμένων αλληλουχιών και η ικανότητα να κόβουν ακολουθίες κοντά στις θέσεις αναγνώρισης τους καθιστούν ισχυρά εργαλεία στον γενετικό πειραματισμό.

Τα θραύσματα που παράγονται από τα ένζυμα περιορισμού που έχουν δράσει σε ένα συγκεκριμένο μόριο ϋΝΑ μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να αναδημιουργήσουν έναν «χάρτη» του αρχικού μορίου χρησιμοποιώντας πληροφορίες σχετικά με τις θέσεις όπου το ένζυμο κόβει το DNA.

Ορισμένα ένζυμα περιορισμού μπορεί να έχουν την ίδια θέση αναγνώρισης στο DNA, αλλά δεν τα κόβουν απαραίτητα με τον ίδιο τρόπο. Έτσι, υπάρχουν ένζυμα που κάνουν κοπές που αφήνουν αμβλύ άκρα και ένζυμα που κόβουν αφήνοντας συνεκτικά άκρα, τα οποία έχουν διαφορετικές εφαρμογές στη μοριακή βιολογία.

Προς το παρόν υπάρχουν εκατοντάδες διαφορετικά εμπορικά διαθέσιμα ένζυμα περιορισμού που προσφέρονται από διαφορετικές εμπορικές κατοικίες. αυτά τα ένζυμα λειτουργούν σαν "έθιμο" μοριακό ψαλίδι για διαφορετικούς σκοπούς.

Ευρετήριο

• 1 Λειτουργίες
• 2 Μηχανισμός δράσης
• 3 τύποι
  • 3.1 ένζυμα περιορισμού τύπου Ι
  • 3.2 Ένζυμα περιορισμού τύπου II
  • 3.3 ένζυμα περιορισμού τύπου III
  • 3.4 Ένζυμα περιορισμού τύπου IV
  • 3.5 Ένζυμα περιορισμού τύπου V.
• 4 Παραδείγματα
• 5 Αναφορές

Λειτουργίες

Τα περιοριστικά ένζυμα εξυπηρετούν την αντίθετη λειτουργία των πολυμεράσεων, εφόσον υδρολύουν ή διασπούν τον εστερικό δεσμό εντός του δεσμού φωσφοδιεστέρα μεταξύ γειτονικών νουκλεοτιδίων σε νουκλεοτιδική αλυσίδα.

Στη μοριακή βιολογία και στη γενετική μηχανική χρησιμοποιούνται ευρέως εργαλεία για την κατασκευή φορέων έκφρασης και κλωνοποίησης, καθώς και για την αναγνώριση συγκεκριμένων αλληλουχιών. Είναι επίσης χρήσιμα για την κατασκευή ανασυνδυασμένων γονιδιωμάτων και έχουν μεγάλο βιοτεχνολογικό δυναμικό.

Οι πρόσφατες εξελίξεις στη γονιδιακή θεραπεία κάνουν την τρέχουσα χρήση περιοριστικών ενζύμων για την εισαγωγή ορισμένων γονιδίων σε φορείς που είναι φορείς για τη μεταφορά τέτοιων γονιδίων σε ζωντανά κύτταρα και που πιθανώς έχουν την ικανότητα να εισάγονται στο γονιδίωμα των κυττάρων για να εκτελέσουν μόνιμες αλλαγές.

Μηχανισμός δράσης

Τα περιοριστικά ένζυμα μπορούν να καταλύουν την κοπή του δίκλωνου DNA, αν και μερικά είναι σε θέση να αναγνωρίσουν μονόκλωνες αλληλουχίες ϋΝΑ και ακόμη και RNA. Η κοπή λαμβάνει χώρα μετά την αναγνώριση των ακολουθιών.

Ο μηχανισμός δράσης συνίσταται στην υδρόλυση του δεσμού φωσφοδιεστέρα μεταξύ μίας φωσφορικής ομάδας και μιας δεοξυριβόζης στη ραχοκοκαλιά κάθε κλώνου DNA. Πολλά από τα ένζυμα είναι σε θέση να κόψουν στο ίδιο σημείο που αναγνωρίζουν, ενώ άλλα κόβουν μεταξύ 5 και 9 ζεύγη βάσεων πριν ή μετά από αυτό..

Κανονικά αυτά τα ένζυμα κόβονται στο 5 'άκρο της φωσφορικής ομάδας, δημιουργώντας θραύσματα ϋΝΑ με ένα άκρο 5' φωσφορυλίου και ένα τελικό άκρο υδροξυλίου 3 '.

Δεδομένου ότι οι πρωτεΐνες δεν έρχονται σε άμεση επαφή με τη θέση αναγνώρισης στο ϋΝΑ, πρέπει να μετατοπιστούν διαδοχικά μέχρι να φτάσουν στη συγκεκριμένη θέση, ίσως μέσω μηχανισμών "ολίσθησης" στον κλώνο DNA..

Κατά τη διάρκεια της ενζυματικής κοπής, η σύνδεση φωσφοδιεστέρα κάθε ενός από τους κλώνους DNA τοποθετείται εντός μιας από τις δραστικές θέσεις των ενζύμων περιορισμού. Όταν το ένζυμο εγκαταλείπει τη θέση αναγνώρισης και κοπής, αυτό επιτυγχάνεται μέσω μη συγκεκριμένων μεταβατικών συσχετίσεων.

Τύποι

Επί του παρόντος, πέντε τύποι ενζύμων περιορισμού είναι γνωστοί. Παρακάτω, μια σύντομη περιγραφή του καθενός:

Ενζύμων περιορισμού τύπου Ι

Αυτά τα ένζυμα είναι μεγάλες πενταμερικές πρωτεΐνες με τρεις υπομονάδες, έναν περιορισμό, μία μεθυλίωση και μία άλλη για την αναγνώριση αλληλουχιών στο DNA. Αυτές οι ενδονουκλεάσες είναι πολυλειτουργικές πρωτεΐνες ικανές να καταλύουν αντιδράσεις περιορισμού και τροποποίησης, έχουν δραστικότητα ΑΤΡάσης και επίσης ϋΝΑ τοποϊσομεράση.

Ένζυμα αυτού του τύπου ήταν οι πρώτες ενδονουκλεάσες που ανακαλύφθηκαν, καθαρίστηκαν για πρώτη φορά στη δεκαετία του 1960 και έκτοτε μελετήθηκαν με μεγάλο βάθος.

Τα ένζυμα τύπου Ι δεν χρησιμοποιούνται ευρέως ως βιοτεχνολογικό εργαλείο, καθώς η θέση κοπής μπορεί να βρίσκεται σε μεταβλητή απόσταση έως και 1.000 ζευγών βάσεων από τη θέση αναγνώρισης, γεγονός που τις καθιστά αναξιόπιστες όσον αφορά την πειραματική αναπαραγωγιμότητα.

Ένζυμα περιορισμού τύπου II

Είναι ένζυμα που αποτελούνται από ομοδιμερή ή τετραμερή που κόβουν ϋΝΑ σε καθορισμένες θέσεις μήκους μεταξύ 4 και 8 bp. Αυτές οι θέσεις κοπής είναι συνήθως παλινδρομικές, δηλαδή, αναγνωρίζουν αλληλουχίες που διαβάζονται με τον ίδιο τρόπο και στις δύο κατευθύνσεις.

Πολλά από τα ένζυμα περιορισμού τύπου II στα βακτήρια κόβουν το DNA όταν αναγνωρίζουν τον ξένο χαρακτήρα τους, αφού δεν διαθέτουν τις τυπικές τροποποιήσεις που πρέπει να έχουν το DNA..

Αυτά είναι τα απλούστερα ένζυμα περιορισμού, καθώς δεν απαιτούν κανένα συμπαράγοντα διαφορετικό από το μαγνήσιο (Mg +) για να αναγνωρίζουν και να κόβουν τις αλληλουχίες ϋΝΑ.

Η ακρίβεια των ενζύμων περιορισμού τύπου ΙΙ στην αναγνώριση και την αποκοπή απλών ακολουθιών στο DNA σε ακριβείς θέσεις τις καθιστά από τις πλέον χρησιμοποιούμενες και απαραίτητες στους περισσότερους κλάδους της μοριακής βιολογίας.

Εντός της ομάδας ενζύμων περιορισμού τύπου II υπάρχουν πολλαπλές υποκατηγορίες που ταξινομούνται σύμφωνα με ορισμένες ιδιότητες που είναι μοναδικές σε κάθε μία από αυτές. Η ταξινόμηση αυτών των ενζύμων γίνεται με την προσθήκη γραμμάτων του αλφαβήτου, από Α έως Ζ ακολουθώντας το όνομα του ενζύμου.

Ορισμένες από τις υποκλάσεις που είναι πιο γνωστές για τη χρησιμότητά τους είναι:

Υποκατηγορία IIA

Είναι διμερή διαφορετικών υπομονάδων. Αναγνωρίζουν ασύμμετρες ακολουθίες και χρησιμοποιούνται ως ιδανικοί πρόδρομοι για την παραγωγή ενζύμων κοπής.

Υποκατηγορία ΙΙΒ

Αυτά αποτελούνται από ένα ακόμη διμερή και κόβουν το DNA και στις δύο πλευρές της ακολουθίας αναγνώρισης. Κόβουν και τα δύο νήματα DNA σε μια σειρά ζευγών βάσεων πέρα ​​από τη θέση αναγνώρισης.

Υποκατηγορία IIC

Τα ένζυμα αυτού του τύπου είναι πολυπεπτίδια με λειτουργίες διαίρεσης και τροποποίησης των κλώνων DNA. Αυτά τα ένζυμα κόβουν αμφότερα τα κλώσματα ασύμμετρα.

Υποκατηγορία ΙΙΕ

Τα ένζυμα αυτής της υποκατηγορίας είναι τα πλέον χρησιμοποιούμενα στη γενετική μηχανική. Έχουν καταλυτική θέση και γενικά απαιτούν αλλοστερικό τελεστή. Αυτά τα ένζυμα πρέπει να αλληλεπιδράσουν με δύο αντίγραφα της αλληλουχίας αναγνώρισης τους για να κάνουν μια αποτελεσματική κοπή. Εντός αυτής της υποκατηγορίας είναι τα ένζυμα EcoRI και EcoRI.

Ένζυμα περιορισμού τύπου III

Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού Τύπου III αποτελούνται από μόνο δύο υπομονάδες, η μία είναι υπεύθυνη για την αναγνώριση και τροποποίηση του DNA, ενώ η άλλη είναι υπεύθυνη για την κοπή της αλληλουχίας.

Αυτά τα ένζυμα απαιτούν δύο συμπαράγοντες για τη λειτουργία τους: ΑΤΡ και μαγνήσιο. Τα περιοριστικά ένζυμα αυτού του τύπου κατέχουν δύο ασύμμετρες θέσεις αναγνώρισης, μετατοπίζουν το DNA κατά τρόπο εξαρτώμενο από ΑΤΡ και το κόβουν μεταξύ 20 έως 30 bp δίπλα στη θέση αναγνώρισης..

Ενζύμων περιορισμού τύπου IV

Τα ένζυμα τύπου IV είναι εύκολο να ταυτοποιηθούν αφού κόβουν το ϋΝΑ με ετικέτες μεθυλίωσης, αποτελούνται από διάφορες διαφορετικές υπομονάδες που είναι υπεύθυνες για την αναγνώριση και την αποκοπή της αλληλουχίας DNA. Αυτά τα ένζυμα χρησιμοποιούν ως συμπαράγοντες GTP και δισθενές μαγνήσιο.

Ειδικές θέσεις για κοπή περιλαμβάνουν νουκλεοτιδικές αλυσίδες με κατάλοιπα μεθυλιωμένης ή υδροξυμεθυλιωμένης κυτοσίνης σε έναν ή αμφότερους τους κλώνους νουκλεϊνικών οξέων.

Ένζυμα περιορισμού τύπου V.

Αυτή η ταξινόμηση ομαδοποιεί τα ένζυμα τύπου CRISPER-Cas, τα οποία αναγνωρίζουν και κόβουν συγκεκριμένες αλληλουχίες ϋΝΑ από εισβάλλοντες οργανισμούς. Τα ένζυμα Cas χρησιμοποιούν ένα κλώνο CRISPER που συνθέτει κατευθυνόμενο RNA για να αναγνωρίσει και να επιτεθεί σε εισβολείς οργανισμούς.

Τα ένζυμα που ταξινομούνται ως τύπος V είναι πολυπεπτίδια δομημένα από ένζυμα τύπου Ι, II και II. Μπορούν να κόψουν τμήματα του DNA σχεδόν οποιουδήποτε οργανισμού και με μεγάλη εμβέλεια μήκους. Η ευελιξία και η ευκολία χρήσης τους καθιστούν αυτά τα ένζυμα ένα από τα πλέον χρησιμοποιούμενα εργαλεία στη γενετική μηχανική σήμερα μαζί με τα ένζυμα τύπου II.

Παραδείγματα

Τα ένζυμα περιορισμού έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση πολυμορφισμών DNA, ειδικά σε μελέτες πληθυσμιακής γενετικής και εξελικτικών μελετών χρησιμοποιώντας μιτοχονδριακό ϋΝΑ, προκειμένου να ληφθούν πληροφορίες σχετικά με τα ποσοστά νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων..

Επί του παρόντος, οι φορείς που χρησιμοποιούνται για τον μετασχηματισμό βακτηριδίων με διαφορετικούς σκοπούς έχουν θέσεις πολλαπλών φατνωμάτων όπου εντοπίζονται θέσεις αναγνώρισης για πολλαπλά ένζυμα περιορισμού..

Μεταξύ αυτών των ενζύμων, τα πιο δημοφιλή είναι τα EcoRI, II, III, IV και V, που ελήφθησαν και περιγράφηκαν για πρώτη φορά Ε. Coli? HindIII, από Η. Influenzae και BamHI B. amyloliquefaciens.

Αναφορές

1. Bickle, Τ. Α., & Kruger, D. Η. (1993). Βιολογία του περιορισμού του DNA. Μικροβιολογικές ανασκοπήσεις, 57(2), 434-450.
2. Boyaval, Ρ., Moineau, S., Romero, D. Α., & Horvath, Ρ. (2007). Το CRISPR παρέχει αποκτηθείσα αντίσταση κατά των ιών σε προκαρυωτικά. Επιστήμη, 315(Μάρτιος), 1709-1713.
3. Goodsell, D. (2002). Η μοριακή προοπτική: Ενδονουκλεάσες περιορισμού. Βλαστοκύτταρα Βασικές αρχές της ιατρικής του καρκίνου, 20, 190-191.
4. Halford, S. Ε. (2001). Εμπλοκή, άλματα και βρόμματα από ένζυμα περιορισμού. Συναλλαγές βιοχημικής κοινωνίας, 29, 363-373.
5. Jeltsch, Α. (2003). Διατήρηση της ταυτότητας των ειδών και έλεγχος των ειδών των βακτηρίων: μια νέα λειτουργία για τα συστήματα περιορισμού / τροποποίησης? Gene, 317, 13-16.
6. Krebs, J., Goldstein, Ε., & Kilpatrick, S. (2018). Τα γονίδια XII του Lewin (12 ed.). Burlington, Μασαχουσέτη: Εκμάθηση Jones & Bartlett.
7. Li, Υ., Pan, S., Zhang, Υ., Ren, Μ., Feng, Μ., Peng, Ν., .. Ε., Q. (2015). Συστήματα CRISPR-Cas τύπου Ι και τύπου III για την επεξεργασία γονιδιώματος. Έρευνα Νουκλεϊκών Οξέων, 1-12.
8. Loenen, W. Α.Μ., Dryden, D.T.F., Raleigh, Ε.Α., & Wilson, G.G. (2013). Ενζύματα περιορισμού τύπου Ι και συγγενείς τους. Έρευνα Νουκλεϊκών Οξέων, 1-25.
9.  Nathans, D., & Smith, Η. Ο. (1975). Περιοριστικές ενδονουκλεάσες στην ανάλυση και αναδιάρθρωση μορίων ϋΝΑ. Annu. Rev. Biochem., 273-293.
10.  Nei, Μ. & Tajima, F. (1981). Ο πολυμορφισμός Dna ανιχνεύσιμος από τις ενδονουκλεάσες περιορισμού. Γενετική, 145-163.
11.  Pingoud, Α., Fuxreiter, Μ., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Κυτταρικές και Μοριακές Επιστήμες της Ζωής Ενδονουκλεάσες περιορισμού τύπου II: δομή και μηχανισμός. CMLS Κυτταρικές και Μοριακές Επιστήμες Ζωής, 62, 685-707.
12.  Roberts, R. (2005). Πώς τα ένζυμα περιορισμού έγιναν οι εργαζόμενοι της μοριακής βιολογίας. PNAS, 102(17), 5905-5908.
13.  Roberts, R.J. & Murray, Κ. (1976). Περιοριστικές ενδονουκλεάσες. Κρίσιμες ανασκοπήσεις στη βιοχημεία, (Νοέμβριος), 123-164.
14.  Stoddard, Β. L. (2005). Δομή και λειτουργία της ενδονουκλεάσης. Τριμηνιαίες ανασκοπήσεις της βιοφυσικής, 1-47.
15.  Tock, Μ. R., & Dryden, D. Τ. F. (2005). Η βιολογία του περιορισμού και του περιορισμού. Τρέχουσα Γνώμη στη Μικροβιολογία, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
16.  Wilson, G. G., & Murray, Ν. Ε. (1991). Συστήματα Περιορισμού και Τροποποίησης. Annu. Rev. Genet., 25, 585-627.
17.  Wu, Ζ., & Mou, Κ. (2016). Γονιδιωματικές γνώσεις σχετικά με τη μολυσματικότητα Campylobacter jejuni και τη γενετική του πληθυσμού. Έλλειψη Dis. Transl. Med., 2(3), 109-119.
18.  Yuan, R. (1981). Δομή και μηχανισμός πολυλειτουργικών περιοριστικών ενδονουκλεασών. Annu. Rev. Biochem., 50, 285-315.